不同墊料對SPF級KM小鼠學習記憶能力影響的分析研究

摘要:

目的

探討非專業加工制作的麥秸墊料、玉米芯墊料、刨花墊料和紙質墊料對SPF級昆明小鼠(KM)學習記憶能力的影響差異,以及不同墊料對小鼠行為學的影響。方法選用SPF級KM小鼠24只,分別使用麥秸墊料、刨花、玉米芯和紙質墊料飼養8周后,開展 MORRIS水迷宮行為學實驗,考察其行為學的變化和學習記憶能力的差異。

結果

麥秸組學習記憶能力增加明顯高于刨花組(P<0.05);水迷宮實驗期間,各組增重差異不顯著。定位航行實驗結果顯示,麥秸組第5d的逃避潛伏期顯著低于其余三組(P<0.05),其余時間段差異無顯著性;空間探索實驗結果顯示麥秸組小鼠穿過原平臺位置的次數、游泳時間均多于其余三組。

結論

不同墊料對水迷宮實驗中KM小鼠的體質量影響較小,麥秸墊料對KM小鼠學習記憶能力的影響優于刨花墊料和玉米芯墊料,建議將麥秸墊料作為實驗動物接觸性墊料推廣使用。

墊料是實驗動物生存環境中的接觸性基礎材料,不同的墊料生存環境直接影響實驗動物的生理活動,進而影響動物實驗結果的準確性,選擇不同墊料也是體現動物福利的重要內涵。因此,實驗動物國家及地方標準對實驗動物墊料的物理性狀、化學及生物特性都有明確的規定和要求。目前所知實驗動物品種、品系、年齡、性別等對實驗動物記憶能力均有不同程度的影響,但未知不同墊料飼養環境對實驗動物記憶認知能力是否有影響。為了進一步探索新型麥秸墊料的安全性及其對嚙齒類實驗動物接觸環境的影響,本實驗采用SPF級昆明小鼠為研究對象,應用 MORRIS水迷宮行為學實驗方法,比較、開發利用新型麥秸墊料和其他3種墊料(刨花墊料、玉米芯墊料和紙質墊料)在工作狀態下對小鼠學習記憶能力和血液生化指標的影響。為今后開展與改善學習記憶能力相關藥物研究的實驗動物墊料選擇提供參考,也為新型麥秸墊料的安全使用和大力推廣提供依據。

1.1實驗動物

SPF級KM小鼠(孕13d)8只,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016 0006],飼養在北京實驗動物研究中心屏障內,小鼠自由進食、進水，溫度:18~26℃,濕度:38%~50%。維持12/12h暗交替光照。所有實驗操作遵循動物使用相要求,福利倫理審查批準號: BLARC2017112401。

1.2墊料及主要儀器

1.2.Ⅰ新型麥秸墊料:利用蒸汽爆破工藝對麥秸原料進行爆破,做進一步處理后,進行Co照射及真空包裝后獲得新型麥秸墊料。玉米芯墊料、刨花料均購自北京科澳協力飼料有限公司;紙質墊料購自北京美綠洲生物科技有限公司。

1.2.2主要儀器:超凈工作臺(蘇杭);電子天平 (Sartorius,BSA220ZS型):水迷宮(ZS40 ZS001 MORRIS水迷宮動物行為分析系統(眾實迪創購自北京美綠洲生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1實驗分組:8只KM孕鼠單籠飼養,2只/籠分別飼養在麥秸墊料、玉米芯、刨花和紙質4種墊料中。選取離乳后仔鼠24只,隨機分為4組,每組6只,雌雄各半,分別按照使用墊料的不同分為麥秸墊料組、玉米芯組、刨花組和紙質墊料組。每周更換次墊料,常規飼養。在相同環境條件下繼續飼養8周后,觀察各組小鼠的相應指標。

1.3.2適應性觀察:觀測KM小鼠分別對4種墊料飼養適應情況,觀察小鼠行為反應、身體清潔度、有無外傷及過敏、嚼食墊料等情況。

1.3.3水迷宮行為學測試:應用ZS-01 MORRIS水迷宮實驗裝置,開展隱藏平臺實驗和空間探索實驗,檢測小鼠在水迷宮裝置中的學習和記憶能力。

1.3.3.1定位航行實驗:連續6d分別對麥秸、刨花、玉米芯及紙質墊料飼養的4組小鼠進行入水訓練和測試,每天訓練4次,確保4個象限每天只用1次。第一天為適應性訓練,將小鼠放入不含平臺的水池中自由游泳120s,每次訓練完成后,迅速用干凈的干毛巾將小鼠擦拭干凈后放回籠盒,并保證其飲水和食物供應,便于小鼠提前適應環境,減少應激反應。其余5d為正式試驗,每天固定時間訓練4次,每次訓練間隔15~20min。訓練時間設置為90s,90s內小鼠未找到站臺,則由實驗人員將其引導至站臺,并在站臺上停留10s,逃避潛伏期記為90s。將逃避潛伏期均值作為參數進行數據統計。

1.3.3.2空間探索實驗:實驗時間為1d,去除平臺中心支架,任選一個象限入水點將KM小鼠放入水中,測試60s小鼠在恒溫池中的游泳時間以及目標(原平臺位置)的次數。

1.3.4體質量的檢測:實驗期間,每天實驗前對所有小鼠進行稱重并記錄

1.4統計方法

采用SPSS22.0軟件進行統計學分析,實驗數據均用平均數±標準差(±s)表示,各組間逃避潛伏期和體質量的比較采用ISD方差分析;各組間穿越站臺次數采用單因素方差分析,P<0.05為差異有顯著性。

2結果

2.1動物適應性研究

通過實驗觀察,麥秸墊料對小鼠無刺激作用,小鼠行為、反應正常。同其他3種墊料相比,換墊料1周后,麥秸墊料相對干燥度良好;相比玉米芯墊料沒有尿液集中滲漏的情況;相比紙質墊料,沒有排泄物裸置的情況。

2.2定位航行實驗

逃避潛伏期結果如表1所示。在5d的定位航行實驗中,各組小鼠的潛伏期均隨著訓練天數的增加而縮短,由此可知,在4種墊料飼養環境下的KM小鼠經過訓練后均可獲得一定的空間學習能力。由圖1可見,自第2天起,麥秸組、玉米芯組和紙質組的潛伏期呈下降趨勢,其中麥秸組較其他3種墊料組具有明顯的優勢。進一步對組內各時間點的潛伏期進行兩兩比較,結果顯示,第5天的潛伏期麥秸組顯著低于其他3組(P<0.05),其余各組間兩兩比較差異不顯著,由此可見經麥秸墊料飼養下的KM小鼠在空間學習能力可得到明顯的提高。

2.3空間探索實驗

實驗結果如圖2所示,各組小鼠穿過目標象限次數、目標象限游泳時間經統計無顯著性差異(P>0.05)。但麥秸組的小鼠在穿過目標象限的總次數、游泳時間上均表現出一定的優勢,其中穿臺次數方面:麥秸組(3、2)最高、刨花組(1、2)、玉米芯組(1、2),紙質組(1);游泳時間方面:麥秸組(17.09s)、刨花組(1122)、玉米芯組(12.21)、15紙質組(16.33s)。這說明在麥秸墊料飼養條件下的KM小鼠可獲得良好的空間學習記憶能力,其對空間定位的準確性明顯高于其他3組。

2.4墊料對KM小鼠體質量的影響

KM小鼠經四種不同墊料相同飼養環境下飼養8周后,體質量均逐漸增加,結果見表2。其中麥秸組增重最大,刨花組增重最小,兩組間變化差異顯著(P<0.05);水迷宮測試期間,各組增重兩兩比較無統計學差異(P>0.05),結果如圖3所示。

3討論

目前,MORS水迷宮實驗廣泛用于開展海馬與腦認知系統的相關研究方面。如 Huang等研究脂多糖對記憶檢索的影響,探討免疫激活與學習記憶功能的相互作用。 Stackman等研究小鼠定向反應與前丘腦神經元之間的關聯。范琳犀等研究發現皮質酮慢性注射可誘導C57小鼠抑郁行為發生改變并損害學習記憶功能。劉港等研究結果表明,采用雄性KM小鼠側腦室注射AB23-35可快速成功制備阿爾茨海默病(AD)小鼠模型。在定位航行實驗中,KM小鼠的逃避潛伏期隨著訓練次數的增加而減少,這與本研究的結果一致。王南溪等用水迷宮實驗測試不同劑量的黃粉蟲油脂對KM小鼠增重及學習記憶能力的影響。胡華等探討活血榮絡片治療阿爾茨海默病的機制。在MORRIS水迷宮實驗過程中,其測試結果不僅與動物種類有關, MORRIS水迷宮的實驗設備、實驗環境(光照、噪聲)等許多因素均會影響實驗結果。周海東等發現平臺顏色可以改變大鼠的水迷宮成績藍色平臺的大鼠學習能力提升速度快于白色平臺組。黃明2發現90dB的噪聲(2h/天)可以導致KM小鼠空間性學習記憶能力和情緒性記憶能力受損。 眾所周知,墊料作為嚙齒類實驗動物生存環境中的重要組成部分,其原料、形狀、大小等因素均會對實驗動物及物實驗結果有不同程度的影響3。越來越多的研究表明,豐富環境可以對小鼠腦損傷具有復蘇的作用,可以改善其記憶和運動能力,認為環境豐富化對嚙齒類動物腦功能改善、減輕老齡化帶來的空間認知和運動缺陷等具有重要生物學意義。唐莉莉6研究發現豐富環境組的KM小鼠表現活躍,探索主動性增加,豐富環境強化小鼠的情緒學習記憶;而貧瘠環境組小鼠活動減少、情緒煩躁不安,氧化應急水平下降,使機體抵抗外界不良環境的能力下降。吳冰潔等通過對近交系衰老模型SAMP8小鼠的研究也發現并證實了環境豐富能刺激、提高動物體內促腎上腺皮質激素(ACTH和皮質醇(Cor)水平,能減輕精神行為異常及顯著提高小鼠的學習及記憶能力。李春祿等通過對野生小家鼠和KM小鼠對豐富環境(鋸末墊料為主,普通環境基礎上添加玩具)的學習記憶能力影響實驗發現早期的豐富環境飼養顯著縮短野生小家鼠的潛伏期,KM小鼠沒有顯著影響,而經過學習訓練野生小家鼠和KM小鼠的潛伏期都顯著縮短。野生小家鼠更有良好的可塑性和應變能力,而實驗KM小鼠經過馴化后對環境變化更容易適應。因此,本實驗選用KM小鼠作為研究對象,這與我們的研究結果致。但是,在刨花與玉米芯等常規墊料飼養中,結果顯示在4種墊料飼養環境下的KM小鼠經過訓練后均可獲得一定的空間學習能力,自第2天起,麥秸組、玉米芯組和紙質組的潛伏期呈下降趨勢,其中麥秸組較其他3種墊料組具有明顯的優勢,但差異不顯著。

據報道,大小鼠的迷宮實驗認知和行為評價的差異也可能和應激反應有關,應激狀態下人類和動物釋放的腎上腺皮質激素影響記憶的形成,損害記憶的獲得和再現。在水迷宮浸水游泳的環境應激下,除了因整體環境因素如墊料富集,增加小鼠的幸福感等對小鼠形成的保護作用,也應該考慮到小鼠個體差異。我們在試驗中發現,雌性小鼠的認知能力顯著高于雄性,這與宿瑞敏研究結果相一致。本實驗發現,新型麥秸墊料可促進KM小鼠體質量增加,且增加情況要優于玉米芯和紙質墊料組,與刨花墊料組相比較差異顯著(P<0.05);舒暢等凹曾報道普通刨花墊料對KM小鼠體質量的增加緩慢,本次結果與之相一致。水迷宮實驗顯示,4種墊料飼養下的小鼠差異不顯著,但結合實際飼養環境來看,紙質墊料組的小鼠表現欠佳,不建議完全用紙質墊料飼養或開展相關研究。麥秸墊料組表則明顯優于刨花墊料和玉米芯墊料組,因此麥秸墊料可以作為實驗動物接觸性墊料推廣使用。
 
 
參考文獻
 
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