與色譜柱相關的問題匯總（二）

  11.關于色譜柱的填裝問題!我個人認為現在色譜柱的填裝一般有3種情況：

　　①國外生產填料并填裝完成成品賣到國內;

　　②國外生產填料，國內填裝銷售;

　　③國內生產填料，國內填裝銷售。

　　一般情況下，第1種情況賣的最貴，也質量最好!可是我就不明白了：如果是填料的生產很復雜的話，那么填裝上國內也跟不上去嗎?為什么換在國內填裝就會出現或多或少的一些小問題呢?

　　答：國內填裝會出現質量小問題，和國內目前普遍做事沒有國外嚴謹有關吧。如果工藝技術上沒有問題，又能制訂并切實執行一整套嚴格的生產質量管理措施，國內填裝和國外填裝并無區別。

　　12.國產色譜柱在市場上占有比例如何啊?

　　答：國內色譜柱市場還沒有人進行過科學統計，連一年色譜柱銷售總量也眾說紛云，更別說國內生產色譜柱所占份額了。我估計是占30%左右吧。

　　13.預柱或保護柱用還是不用的問題!原來分析中藥品種時，我一直都是用保護柱。但來到新公司后，發現大家都沒有使用，幾個實驗室連保護柱都沒找到一個，也就是說大家從來都沒有用過。后來問一個老員工，說是有可能影響藥品分析。我就想問：安裝保護柱后會影響樣品分析嗎?我們做的大多是頭孢類的抗生素。

　　答：應該這樣說，加上保護柱，肯定有利于保護色譜柱不受一些顆粒物質的堵塞，肯定有害于分離度和柱效，因為保護柱中間有著死體積的存在但是如果保護柱接得好并且盡量控制其匹配性和經常更換，分離度和柱效應該影響并不大。

　　頭孢類的抗生素也要看到底是原料藥還是制劑嘍，有些原料藥，可以根據色譜柱的損耗選擇添加預柱(中間是個篩板)，制劑的話，如果有輔料嚴重干擾或者流動相鹽分比較大，那還是最好配個保護柱。

　　14.用的是四元梯度泵：A：50%甲醇;B：50%水， 經常出現停或進氣泡這是什么原因?

　　答：水/甲醇比例在55：45時，黏度和柱壓有個極大值。50：50接近了這個極值，柱壓是比較高的，但，影響柱壓最大的還是填料粒徑和色譜柱內徑，你這個實例中不知用的什么規格的色譜柱?系統壓力高，可能會因溶劑泵中的過濾頭供液速度跟不上而導致氣泡進入系統，停機也應該是因為氣泡進入壓力下降的原因，可考慮更換液體通量更大的過濾頭。

　　15.填料方法的前三種都是濕法嗎，能不能對四種填充方法做一個簡短的說明?

　　答：資料顯示：在正常條件下，填料粒度>20μm時，干法填充制備柱較為合適;顆粒<20μm時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種

　　① 高壓勻漿法，多用于分析柱和小規模制備柱的填充;

　　② 徑向加壓法，WatersZL;

　　③ 軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱;

　　④干法。柱填充的技術性很強，大多數實驗室使用已填充好的商品柱。為什么以20μm為分界點?

　　16.想請您具體說明一下反沖色譜柱的方法，是不連檢測器嗎?

　　答：反沖就是將柱子反向連到系統中。因為，有污染物反沖出來，當然不連檢測器，出液端直接接到廢液瓶就可以。

　　17.如果不使用不銹鋼接頭，而改用peek頭，是否可以完全解決接頭匹配問題?

　　答：色譜柱接頭其實大都不是色譜柱廠商自己生產的，供貨商有多個，VICI，Upchurch，Parker等，他們的標準相互之間不統一，那色譜柱接頭的標準就統一不起來。不過一般這個問題也不難解決的，換個接頭就可以了，而且現在有了萬用接頭，可以配所有不同類型的柱頭，不泄露，連接死體積又很小。

　　18.有的廠商為避免堵塞，使用了較大孔徑(2～5μm)的前篩板，這種情況反沖會將填料沖出。那么，你們在使用說明書中會說明前后篩板的孔徑嗎?

　　答：如果前后篩板孔徑不對稱，廠商肯定也會在說明書里特別提到的。

　　19.我在做多肽藥物時遇到下列問題：

　　1)基線不穩定波動大，流動相 A ：

　　1%TF，A：水溶液，B：1%TFA乙腈溶液檢測波長210nm流速1.0mL/mL 什么原因?怎么解決?TFA有什么作用?流動相中不加TFA見不到主峰，基線良好。

　　2)做完肽類樣品時怎么沖洗C18比較好;

　　3)藥典上介紹測定分子量大于2000的樣品，選擇柱子填料的孔徑為30nm，30nm與10nm對結果有什么區別?

　　答：應該是起“離子對”的作用吧。在做多肽類樣品的時候，300A孔徑的填料相對100A孔徑肯定要選擇性好點，也就是分離度相對比較好點。流動相加入TFA，在反相色譜分離多肽和蛋白質的實驗中，使用三氟乙酸(TFA)作為離子對試劑是常見的手段。流動相中的三氟乙酸通過與疏水鍵合相和殘留的極性表面以多種模式相互作用，來改善峰形、克服峰展寬和拖尾問題。

　　※三氟乙酸優于其他離子修飾劑的原因是它容易揮發，可以方便地從制備樣品中除去。另一方面，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于200nm ，對多肽在低波長處的檢測干擾很小。

　　20.waters，Atlantis C18柱可以用較高比例的流動相，那麼用完后應該怎麼清洗?在什麼體系中保存比教合適?

　　答：反相柱都可以用下面通用的方法清洗維護：

　　流動相中不含緩沖鹽：

　　分析完成后，用甲醇(或乙腈)：水=90：10反向沖洗色譜柱45min

　　流動相中含有緩沖鹽：

　　分析完成后，先用甲醇(或乙腈)：水=10：90反向沖洗45min，然后再用甲醇(或乙腈)：水=90：10反向沖洗色譜柱45min;(注意：甲醇(或乙腈)：水=10：90容易長菌，使用時間不可超過3天);

　　水性柱保存體系也不特別：

　　短期保存在所用的流動相中(不含緩沖鹽)，中長期保存在純甲醇(乙腈)或80%的甲醇(乙腈)/水中。