全二維氣相色譜柱組分類標準化協議的開發

一維氣相色譜 (1D-GC) 固定相通常根據其相對極性分為非極性、半極性和極性柱。在全二維氣相色譜 (GC×GC) 中，兩個串聯組裝固定相之間的極性差異決定了色譜柱組合的選擇性。這種極性差異稱為正交性，GC×GC 色譜柱組可根據主色譜柱和次色譜柱之間串聯耦合的方向大致分為四類。目前使用的 GC×GC 色譜柱組中很大一部分以正向正交性操作模式，這意味著次級柱比主柱極性更強。越來越多的報道的 GC×GC 應用在反向正交配置中運行，其中次級柱的極性小于主柱。非正交柱組的例子很少，因為當兩個相相同或極性接近時，次級柱可以提供的額外選擇性有限，而主柱已經實現了分離。第四組 GC×GC 柱組稱為混合正交，涉及固定相與特殊選擇性差異的耦合，這些差異在二維分離圖中表現出來。在這項工作中，我們提出了一種標準化的 GC×GC 柱組表征方法，該方法基于使用稱為 Century Mix 的標準參考混合物。Century Mix 包含 100 種具有不同功能的化學探針，這些探針涵蓋了合理的揮發性和極性范圍，以捕獲任何 GC×GC 柱組的選擇性特征。Century Mix 還包含用于 1D-GC 柱表征的重要化學探針（例如 Grob 混合物和 Rohrschneider/McReynolds 化合物），以在 1D-GC 構建塊柱和 GC×GC 柱組之間建立一些聯系。最后，我們還概述了評估 GC×GC 系統的整體性能時應考慮的一些其他重要的比較指標。

任何色譜方法的目標 都是在盡可能短的時間內完全分離所有目標分析物，并具有良好的峰形屬性。因此，色譜柱的選擇是方法開發工作流程中非常重要的決定，而固定相的分類有助于這一過程。在一維氣相色譜 (1D-GC) 中，固定相的選擇性和性能特征通過常用的混合物提供，例如 Rohrschneider/McReynolds 化合物或 Grob 測試化合物 (1,2)。這些混合物含有化學探針，可提供有關固定相相對極性的信息，其中極性被定義為溶質和固定相之間發生的多種特定相互作用（靜電偶極子、氫鍵、電子給體-受體以及離子或共價鍵形成）的綜合效應。

全二維氣相色譜 (GC×GC) 的選擇性優勢在于，通過結合兩種偶聯固定相的特性，可以提高分離能力。此外，GC×GC 分離是結構化的，二維 (2D) 輪廓圖色譜圖可被認為是顯示兩個主要梯度的圖 - 主要維度是揮發性梯度軸，次要維度是極性梯度軸。這就是為什么 GC×GC 色譜圖通常具有具有相似官能團的化合物的可辨別模式，這在非目標分析中非常有用，可用于在用分析標準確認未知化合物之前對其進行推定鑒定 (3)。

由于可能存在大量組合，因此對所有可能的 GC×GC 色譜柱組進行詳盡分類并不實際。但是，可以根據所耦合固定相的相對極性將 GC×GC 色譜柱組分為幾組，如圖 1a 所示。對 2023 年 140 篇同行評審出版物的調查（使用 SciFinder Scholar 中的關鍵詞“綜合二維氣相色譜”）表明，相當一部分 GC×GC（55%）項目以“正向”（或“正常”）正交模式運行，其中主色譜柱的極性低于次色譜柱。這些色譜柱組合包括圖 1a 中的非極性/半極性（39%）、非極性/極性（16%）和半極性/極性（0%）部分。但是，值得注意的是，“反向”正交配置（半極性/非極性、極性/非極性和極性/半極性）的數量顯著增加（44%），是 Focant 和 Stefanuto 上次審查的三倍多，上次審查報告了此類調查（4）。這是一個積極的趨勢，因為這意味著 GC×GC 方法開發人員開始使用更多可用的選擇性。圖 1b 顯示了來自相同調查數據的應用領域餅圖。食品和風味方法似乎正在興起（占報告工作的 40%），石化、環境和生物分析應用之間保持著良好的平衡。還應注意，所有這些應用領域都使用了正向和反向正交柱組，并且，GC×GC中色譜柱組的選擇更多地取決于被分離分析物的性質和多樣性（就功能組而言），而不是應用領域。

圖1：2023年GC×GC同行評審出版物調查結果：（a）列集分類；（b）應用領域分類。

人們普遍認為，GC×GC 分離的質量取決于極性差異（稱為正交性) 在主色譜柱和副色譜柱之間的正交性很高，因此，歸類為非正交的色譜柱組（圖 1a 中的非極性/非極性、半極性/半極性和極性/極性）沒有其他組合使用得那么頻繁也就不足為奇了。然而，非正交 GC×GC 系統的演示確實存在，而且當目標分析物（由于熱或化學過程）在柱上轉化為相關物種是該方法的分析策略的一部分時，這種演示似乎是合理的。Marriott 及其同事最近報道了使用 Rxi-1 MS/DB-5 色譜柱組合監測熱異構化反應中的除蟲菊酯異構體 (5)。在極性尺度的另一端，2013 年，Delmonte 及其同事展示了如何使用 SLB-111/SLB-111 色譜柱組通過在調節器中使用柱上加氫來分離脂肪酸甲酯 (6)。還應注意，當連接極性差異很大的色譜柱時，一個固定相上分析物的峰形可能會受到另一個固定相上的影響，從而降低有效分離度和檢測限。出于這些原因，重新理解 GC×GC 中的正交性和選擇性概念非常重要。我們堅信還有更多相關的色譜柱組合值得探索，這項工作的目標是開發一種標準的化合物混合物，以幫助更好地對可能的 GC×GC 色譜柱組合網格進行分類。

世紀組合

盡管多年來石油基樣品（如汽油、柴油或噴氣燃料）一直用于表征 GC×GC 系統，但為了進行更有效的比較，更理想的是使用更標準化的混合物。2003 年，為此開發了一種 80 種化合物的混合物，它是 Grob 混合物的擴展，以更好地覆蓋二維化學空間 (7)。這種混合物被稱為菲利普斯混合物，以紀念已故的約翰·B·菲利普斯教授（GC×GC 的發明者）。多年來，出于各種原因，這種混合物不斷被修改，例如去除可能降低整體混合物穩定性的化合物或添加化合物以捕獲更合理的二維化學空間部分。目前提出的混合物含有 100 種化合物，稱為Century 混合物（混合物中化合物的功能概述見表 I）。盡管這種混合物目前尚未在市場上銷售，但美國食品藥品管理局 (FDA) 和美國國家標準與技術研究所 (NIST) 正在支持一項跨機構合作，以開發這種混合物，從而根據目前市場上存在的多種不同 GC×GC 儀器變體來標準化儀器性能指標。

使用此標準混合物的一個重要組成部分是操作條件的標準化。在開發的現階段，正在使用熱調制儀器，這里報告的參數適用于這些系統。該混合物適用于所有 GC×GC 系統，并計劃為此評估進行實驗室間研究。使用氦氣作為載氣，流速為 1.0 mL/min。在分流/不分流系統（使用 100:1 分流）上進行注射，注射量為 1 μL。主柱尺寸為 30 m 長，內徑為 250 μm，膜厚為 0.25 μm。次柱尺寸為 2 米長，內徑為 250 μm，膜厚為 0.25 μm。主柱溫度程序從初始溫度 40 °C 開始，持續 2 分鐘，然后以 5 °C/min 的速率升溫至 230 °C 并保持 10 分鐘。分析運行時間為 50 分鐘，輔助柱箱的編程速率比主柱箱高 5 °C。調制器溫度偏移比主箱高 15 °C，熱脈沖時間為 0.6 秒。根據保留最多的分析物的洗脫時間調整調制周期以避免任何環繞峰。進入飛行時間質譜儀 (TOF-MS) 的傳輸線溫度為 280 °C，以 100 張光譜/秒的速率收集光譜，范圍在 35 至 500 amu 之間。離子源溫度為 225 °C，電子電離能為 70 eV。并且次級柱溫箱的升溫速度比主柱溫箱高 5°C。調制器溫度偏移比主柱溫箱高 15°C，熱脈沖時間為 0.6 秒。調制周期根據保留時間最長的分析物的洗脫時間進行調整，以避免出現任何環繞峰。進入飛行時間質譜儀 (TOF-MS) 的傳輸線溫度為 280°C，在 35 至 500 amu 的范圍內以 100 光譜/秒的速率收集光譜。離子源溫度為 225°C，電子電離能為 70 eV。并且次級柱溫箱的升溫速度比主柱溫箱高 5°C。調制器溫度偏移比主柱溫箱高 15°C，熱脈沖時間為 0.6 秒。調制周期根據保留時間最長的分析物的洗脫時間進行調整，以避免出現任何環繞峰。進入飛行時間質譜儀 (TOF-MS) 的傳輸線溫度為 280°C，在 35 至 500 amu 的范圍內以 100 光譜/秒的速率收集光譜。離子源溫度為 225°C，電子電離能為 70 eV。調制周期根據保留時間最長的分析物的洗脫時間進行調整，以避免出現任何環繞峰。進入飛行時間質譜儀 (TOF-MS) 的傳輸線溫度為 280 °C，光譜收集速率為 100 光譜/秒，范圍在 35 至 500 amu 之間。離子源溫度為 225 °C，電子電離能為 70 eV。調制周期根據保留時間最長的分析物的洗脫時間進行調整，以避免出現任何環繞峰。進入飛行時間質譜儀 (TOF-MS) 的傳輸線溫度為 280 °C，光譜收集速率為 100 光譜/秒，范圍在 35 至 500 amu 之間。離子源溫度為 225 °C，電子電離能為 70 eV。

圖 2a 顯示了 Century 混合物在正向正交性色譜柱組上的等高線圖色譜圖，其中主色譜柱為 Rxi-5Sil MS 主色譜柱（30 m，250 μm 內徑，0.25 μm 膜），連接到 Rxi-17Sil MS（2m，250 μm 內徑，0.25 μm 膜）次級色譜柱。主色譜柱分離范圍以 C ₆（己烷）和 C _{20之間的烷烴（在色譜圖底部洗脫）為標志}（二十烷）。第二柱梯度的方向以芳香烴（苯、萘和菲）為標志，這些化合物在第二維時間增加時被洗脫，這表明第二柱極性高于第一維極性。柱組的選擇性可以通過同源化合物系列的洗脫順序來描述。在這種情況下，洗脫順序如下：烷烴<烯烴<仲醇<伯醇<脂肪酸<羧酸<酮<烷基苯<內酯<鄰苯二甲酸酯。混合物中所有化合物的峰形似乎相當對稱，這表明分離效果可接受。除了這些基本的比較參數外，Century 混合物中的其他探針用于建立與 1D-GC 指標以及其他性能指標（例如峰形和二維化學空間的有效利用）的聯系，但本文不會詳細討論這些內容。

圖 2：兩組正向正交色譜柱的 GC×GC 輪廓圖色譜圖，附有峰頂圖，其中識別出一些同源系列（對于芳香烴化合物，B 為苯，N 為萘，P 為菲）。主軸和次軸的保留時間以秒為單位。（a）Rxi-5Sil MS/Rxi-17Sil MS 色譜柱組合；（b）ZB-5 MS/VF-200 色譜柱組合。

圖 2b 顯示了 Century 混合物在與圖 2a 中所示的不同正向正交性色譜柱組上的等高線圖色譜圖。在這種情況下，主色譜柱是 ZB-5MS 色譜柱（30 m，250 μm 內徑，0.25 μm 膜），連接到 VF-200（2 m，250 μm 內徑，0.25 μm 膜）輔助色譜柱。盡管兩種色譜柱都屬于“非極性/半極性”類別，但圖 2b 中產生的 2D 分離梯度與圖 2a 中的不同，這意味著第二組色譜柱的選擇性與第一組色譜柱略有不同。選擇性差異的一個明顯指標是同源系列的洗脫順序，如下所示：烷烴 < 烯烴 < 烷基苯 < 一級醇 < 二級醇 < 羧酸 < FAMES < 酮 <鄰苯二甲酸酯 < 內酯。值得注意的是，同一分類類別的色譜柱的洗脫順序發生了變化，因為這表明 GC×GC 中的選擇性并不局限于給定的一般固定相類別，這些梯度應該更詳細地研究。既然我們可以監測 Century 混合物中所有目標分析物的色譜圖之間的差異，研究使用不同操作參數可以產生的選擇性的其他變化也將很有趣。既然我們可以監測 Century 混合物中所有目標分析物的色譜圖之間的差異，那么研究通過不同的操作參數可以產生的選擇性的額外變化也將很有趣。既然我們可以監測 Century 混合物中所有目標分析物的色譜圖之間的差異，那么研究通過不同的操作參數可以產生的選擇性的額外變化也將很有趣。

預測 GC×GC 色譜圖

過去幾年中，有幾個研究小組致力于 GC×GC 的預測建模 (8–12)。在本文中，我們將介紹一種非常簡單的方法來生成預測性 GC×GC 圖，這可能有助于查看可能尚未嘗試但可能提供一些有趣的選擇性選項的色譜柱組合。此方法的唯一要求是在本文第 2 部分描述的操作條件下對目標固定相生成兩個色譜圖。將針對給定的一組目標分析物和一組烷烴獲得這些色譜圖，以計算每種化合物的保留指數值，如表 II 所示。預測色譜圖表示第一根色譜柱的程序升溫保留指數和第二維中的特定指數 (ΔI)，后者通過從第二根色譜柱的保留指數中減去第一根色譜柱的保留指數而獲得。預測 GC×GC 圖表示二維平面中的相對位置（而不是精確的保留時間），它們有助于確定哪些色譜柱組合可能提供一些有趣的選擇性。在比較不同的色譜柱組時，這些圖還可以為一組目標分析物的化學空間占用情況提供有價值的視覺估計。對于那些在無法使用儀器的實驗室中評估 GC×GC 的潛在效用的個人來說，這些預測圖的價值非常重要。這是通過從第二根色譜柱的保留指數中減去第一根色譜柱的保留指數而得到的。預測性 GC×GC 圖表示的是 2D 平面中的相對位置（而不是精確的保留時間），它們有助于確定哪些色譜柱組合可能提供一些有趣的選擇性。在比較不同的色譜柱組時，這些圖還可以提供一組目標分析物化學空間占用的寶貴視覺估計。這些預測圖的價值對于評估無法使用儀器的實驗室中 GC×GC 的潛在效用的個人來說非常重要。這是通過從第二根色譜柱的保留指數中減去第一根色譜柱的保留指數而得到的。預測性 GC×GC 圖表示的是 2D 平面中的相對位置（而不是精確的保留時間），它們有助于確定哪些色譜柱組合可能提供一些有趣的選擇性。在比較不同的色譜柱組時，這些圖還可以提供一組目標分析物化學空間占用的寶貴視覺估計。這些預測圖的價值對于評估無法使用儀器的實驗室中 GC×GC 的潛在效用的個人來說非常重要。預測性 GC×GC 圖表示的是 2D 平面中的相對位置（而不是精確的保留時間），它們有助于確定哪些色譜柱組合可能提供一些有趣的選擇性。在比較不同的色譜柱組時，這些圖還可以提供一組目標分析物化學空間占用的寶貴視覺估計。這些預測圖的價值對于評估無法使用儀器的實驗室中 GC×GC 的潛在效用的個人來說非常重要。預測性 GC×GC 圖表示的是 2D 平面中的相對位置（而不是精確的保留時間），它們有助于確定哪些色譜柱組合可能提供一些有趣的選擇性。在比較不同的色譜柱組時，這些圖還可以提供一組目標分析物化學空間占用的寶貴視覺估計。這些預測圖的價值對于評估無法使用儀器的實驗室中 GC×GC 的潛在效用的個人來說非常重要。在比較不同的色譜柱組時，這些圖還可以提供一組目標分析物化學空間占用的寶貴視覺估計。這些預測圖的價值對于在沒有儀器的實驗室中評估 GC×GC 潛在效用的個人來說非常重要。在比較不同的色譜柱組時，這些圖還可以提供一組目標分析物化學空間占用的寶貴視覺估計。這些預測圖的價值對于在沒有儀器的實驗室中評估 GC×GC 潛在效用的個人來說非常重要。

圖 3a 顯示了“混合”正交性色譜柱組的預測圖，該圖由 Rtx-17 第一維色譜柱和 VF-200 第二維色譜柱獲得（該圖使用了表 II 中為全套 Century Mix 化合物生成的數據）。這兩種色譜柱都被認為是半極性的，傳統上不會認為它們足夠“正交”而無法用于 GC×GC。從表 II 中的 ΔI 數據可以看出，烷烴的上方和下方都有值，這在 GC×GC 色譜圖中并不常見。正向正交性系統通常將烷烴置于色譜圖底部（保留最少），而反向正交性系統將烷烴置于色譜圖頂端（保留最多）。然而，在 2012 年，Seeley 及其同事展示了一個使用兩種半極性固定相（DB-210/HP-50 組合）進行分離的實例，該實例能夠將脂肪酸甲酯 (FAME) 雜質從石油樣品中分離出來 (13)。FAME 化合物在色譜圖底部與石油樣品的其余部分有選擇性地分離，這是一個非常不尋常的結果。使用 Century 混合化合物，我們觀察到了類似的結果，只是在這種情況下，同源系列的烷基苯和烯烴在烷烴下方洗脫。FAME 化合物實際上在烷烴上方洗脫，因為三氟丙基固定相是次級色譜柱，并且與 Seeley 色譜柱組具有相反的選擇性，其中三氟丙基固定相用作主色譜柱。

圖 3：反向混合正交柱組上的 GC×GC Century 混合分析。（a）預測圖，其中識別出一些同源系列（對于芳香烴化合物，B 為苯，N 為萘，P 為菲）；（b）峰頂圖，其中識別出一些同源系列。主軸和次軸的保留時間以秒為單位；（c）等高線圖色譜圖。主軸和次軸的保留時間以秒為單位。

圖中還正確預測了其余同源化合物系列的洗脫順序（如圖 3b 所示）。圖 3c 顯示了 GC×GC 色譜圖的實際輪廓圖，盡管由于除同源化合物系列外還存在許多其他化合物，因此目標分析物的身份更難辨別。為了應對以前未嘗試過的色譜柱組合中可能出現的異常保留模式，我們準備了一組確認混合物，這些混合物可以單獨運行，以便在必要時分離特定的功能。當使用單通道檢測器（如火焰離子化檢測器 [FID]）時，這些完整混合物的子集也很重要，因為單通道檢測器無法提供質譜儀 (MS) 能夠生成的有關峰身份的額外信息。內標（喹啉）也是一種可用的化合物，可以將其添加到 Century 混合物中以生成信號比信息，這在比較不同檢測器的信號強度時非常有用。這類信息在評估新合成固定相的潛力時非常有用，例如 Ryoo、Anderson 及其同事最近報道的聚合物離子液體相 (14)。內標（喹啉）也是一種可用的化合物，可以將其添加到 Century 混合物中以生成信號比信息，這在比較不同檢測器的信號強度時非常有用。此類信息在評估新合成固定相的潛力時非常有用，例如 Ryoo、Anderson 及其同事最近報道的聚合物離子液體相 (14)。內標（喹啉）也是一種可用的化合物，可以將其添加到 Century 混合物中以生成信號比信息，這在比較不同檢測器的信號強度時非常有用。此類信息在評估新合成固定相的潛力時非常有用，例如 Ryoo、Anderson 及其同事最近報道的聚合物離子液體相 (14)。

結論

為了改進方法開發的分析策略，我們需要更好地理解 GC×GC 化學空間第二維中起作用的分離梯度。我們希望這種標準化混合物的開發將有助于提高我們對色譜柱選擇性的認識，我們計劃研究更多的色譜柱組，以進一步了解 GC×GC 中正交性和分離效率之間的關系。我們還堅信，需要針對各種固定相開發一個在標準操作條件下獲得的保留指數信息數據庫，以幫助完成色譜柱選擇任務。該數據庫還應提供有關標稱濃度下的峰不對稱性和峰寬等指標的信息，以幫助開發下一代 GC×GC 預測模型。

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