專家指南：如何開展基因表達研究（二）

　　Q2：您采取哪些質量控制步驟?

　　Gary Hardiman(加州大學圣地亞哥分校)

　　對于涉及RNA的應用，利用安捷倫的生物分析儀或類似產品對RNA樣品進行質量控制是必需的，可確保RNA是完整的，沒有降解。對于芯片，cRNA 的生物分析儀分析也很有用，可確保雜交之前均一的轉錄本擴增。芯片上對照探針的行為可警告數據的潛在問題。對于RNA測序，RNA通常片段化，并逆轉錄成 cDNA，加上接頭。利用安捷倫的生物分析儀或2200 TapeStation對RNA-seq文庫進行QC很重要，可確保插入片段存在，且文庫中沒有引物二聚體。在測序之前，應該通過qPCR對DNA進行準確定量，這能夠指導DNA的上樣量。對于qPCR表達研究，必須使用適當的看家基因來校正不同樣品的起始量，它還能作為RNA完整度的指標。

　　Chris Harrington(俄勒岡健康與科學大學)

　　中心實驗室收到的所有RNA樣品都會利用我們的RNA評估服務來評估。這包括數量、純度和質量(完整性)的測定。預計濃度高于20 ng/μl的樣品會使用紫外分光光度計定量。更稀的樣品會在測定之前濃縮，如果數量有限，則利用RiboGreen熒光分析定量。在定量之后，利用安捷倫的生物分析儀或Caliper的LabChip GX檢查RNA樣品的大小分布。隨后評估濃度測定的結果、UV260/280和UV260/230的比值以及電泳圖，來確定每個樣品的整體質量。我們認為在表達分析中最好使用質量差不多的樣品，以免帶來質量偏差。

　　在選擇RNA進行圖譜分析之后，每個樣品還需要額外的QC步驟，這取決于所使用的技術平臺。一般而言，cDNA文庫(RNA-seq)以及cRNA或cDNA目標(芯片)都經過紫外分光光度計定量，并在生物分析儀上分析。測序文庫在模板制備之前還要通過PCR定量。

　　Craig Praul(賓夕法尼亞州立大學)

　　在基因表達研究中，良好的RNA質量對產生準確一致的結果很關鍵。許多實驗室尚未意識到分離高質量RNA的重要性，以及從某些組織中分離好的RNA有多難。

　　我們采用NanoDrop和安捷倫的生物分析儀，偶爾使用Qubit進行RNA質量控制。研究人員須清楚了解這些儀器的能力，才能正確使用。 NanoDrop通過測定260/280和260/230比值來評估RNA的純度。不過NanoDrop不能評估RNA的質量，也不能了解污染DNA的存在，因為DNA的光譜性質與RNA非常相似。

　　安捷倫的生物分析儀可用于評估RNA質量。此儀器產生RIN值(RNA完整性指數)，是RNA質量的客觀測定。RNA值在1-10之間變化，其中 10代表最高質量。我們不使用硬指標，因為從某些組織中很難獲得高質量的RNA。不過，我們通常不使用RIN低于6-7的樣品(困難組織)，預計組織培養物的RIN值在9-10。與RIN值同樣重要的也許是一組樣品的RIN值范圍。我們希望看到的范圍是1到1.5。對于組中的異常值樣品，我們通常建議重新分離。例如，如果一組中的大部分樣品的RIN值都在9-10，但有幾個在7-8，我們會擔心那些。我們正試圖避免差異降解被誤認為是差異表達。

　　大部分RNA分離方法都產生高純度的RNA，污染DNA很少，但有時候DNA也會是問題。為了準確評估RNA濃度和污染DNA的濃度，我們使用Qubit。這種儀器采用熒光染料特異結合來實現混合物中RNA和DNA的準確定量。

　　Ralph Schlapbach(瑞士聯邦理工學院)

　　無論選擇了何種技術，芯片或測序，所有樣品都在生物分析儀上分析，以檢查完整性，并確定RNA或DNA是否降解。通過熒光定量(Qubit)再次確定樣品濃度。由于某些應用需要特定的片段長度，我們會在生物分析儀、Caliper GX或安捷倫的Tape Station上檢查大小分布和濃度。如果所有QC步驟都順利通過，我們就可以放心地保證定義的分析產量，對于HiSeq測序，每個通道是25-30 Gb Q30數據。在數據方面，新一代測序的讀取首先經過堿基質量和序列內容的質量控制。對于de novo轉錄組測序項目，首先預處理原始讀取，去除低質量的數據和污染物。我們進一步控制芯片雜交數據以及新一代測序數據，發現RNA降解的潛在跡象。

　　Q3：您采用哪些方法來標準化數據?

　　Chris Harrington(俄勒岡健康與科學大學)

　　在中心實驗室，我們一般不開展數據標準化，只是作為芯片數據標準處理的一部分。對于芯片，我們使用芯片供應商提供的默認標準化算法。對于qPCR，我們利用單個參考基因或一組參考基因來標準化數據。

　　Ralph Schlapbach(瑞士聯邦理工學院)

　　標準化方法的選擇在于表達水平的假設和數據中可能存在的偏向。標準的假設是研究中絕大部分基因的表達水平不變，上調和下調是對稱的。鑒于這一假設，對數表達值的中值或平均值都是很好的選擇。如果數據表現出信號依賴的偏向，那么信號依賴的標準化是必要的。許多行之有效的處理方法都有內置的標準化，例如，Affymetrix的RMA總結方法包括分位數標準化(quantile normalization)。一般來說，我們以同樣的方式處理表達估計值，而不管它們是通過測序還是芯片產生的。