專家指南：如何研究基因調控（一）

隨著基因組學研究的深入，人們已經不再滿足于了解基因的功能，而是對基因調控表現出愈加濃厚的興趣。現在，我們知道，DNA甲基化和組蛋白修飾可調控基因，microRNA和非編碼RNA也可以。基因調控的研究工具也越來越多，包括RNA-seq、ChIP-seq、ChIP-chip等。究竟該采用哪種方法來測定miRNA表達，如何確定這些RNA對基因調控的影響呢？《Genome Technology》特邀了一些這方面的專家，向大家介紹他們如何應對挑戰，他們喜歡使用哪些軟件，以及他們如何應用現有的工具。

Q1：檢測非編碼RNA和microRNA表達的最佳方法是什么？
Q2：您如何測定這些RNA對基因調控的影響？
Q3：為了確定表觀遺傳學因素對基因表達調控的影響，測定DNA甲基化或組蛋白修飾哪個更有用？為什么？
Q4：您采用什么方法來解決在ChIP-seq/ChIP-chip數據集中鑒定DNA motif的問題？
Q5：在定位蛋白-DNA相互作用時，為降低DNA污染和片段化所引起的假陽性，同時也避免太嚴格的數據過濾所引起的假陰性，您的主要方法是什么？
Q6：在ChIP-seq/ChIP-chip數據分析時，您首選的計算工具是什么？

Q1：檢測非編碼RNA和microRNA表達的最佳方法是什么？

Marc Facciotti（加州大學戴維斯分校）：

我主要研究微生物，因此我的答案多與微生物研究相關。

我想這個問題的答案取決于特定情況，您是否需要定量已知RNA的豐度，或發現新的ncRNA或microRNA。對于發現研究，特別是目前沒有參考基因組時，RNA-seq似乎很合適。如果您研究一種具體的微生物分離株，目前已有基因組序列，那么高密度芯片可能非常有效。qPCR也是一個定向研究的選擇。

Kun Huang（俄亥俄州立大學）：

對于篩查和發現研究，RNA-seq或smRNA-seq很理想。不過，研究人員應當特別注意提取RNA的步驟、文庫制備和測序方法。對于已知microRNA的測定，定量方法如NanoString是個不錯的選擇。

Xiaole Shirley Liu（Dana-Farber 癌癥研究所）：

在測定RNA水平時，可以采用RNA-seq或smRNA-seq。隨著測序通量和多重分析的增加，它們變得比芯片便宜，也給出了更高質量的數據。為了測定轉錄速率，人們已開發出新的技術，如GRO-seq或NET-seq。這兩種技術比RNA-seq略為復雜，但研究人員也正在優化和簡化操作步驟。許多研究小組開始采用這些技術。在研究瞬時或動態轉錄變化時，它們提供了豐富的信息。

Jun Song（加州大學舊金山分校）：

新一代測序和芯片為檢測非編碼RNA和小RNA的表達水平提供了互補的方法。目前，一個可通過多重測序同時測定6個或更多microRNA樣品的序列。另一個可設計定制tiling芯片，覆蓋基因組中的非編碼RNA。

Q2：您如何測定這些RNA對基因調控的影響？

Xiaole Shirley Liu（Dana-Farber 癌癥研究所）：

在大多數情況下，我們希望了解轉錄因子或染色質調控因子的結合是否會影響基因調控。對于轉錄因子，我們常常觀察到，結合的數量和強度越大，結合點與基因起點越接近，則轉錄影響越強。在表觀遺傳學上，基因表達似乎是激活和抑制mark之間的定量平衡。

siRNA/miRNA可在轉錄后調控基因，在過去十年中有大量工作是圍繞于此。最近也發現了許多非編碼RNA，它們在轉錄或表觀遺傳水平調控基因表達，如piRNA、Xist、HOTAIR和eRNA。這一領域仍非常新，有許多未知的東西。

Jun Song（加州大學舊金山分校）：

研究非編碼RNA的功能仍然是一個重大挑戰。您可以在knockdown一個特定的非編碼RNA之前和之后開展RNA-seq。通過比較兩個數據集的整體表達模式，了解非編碼RNA的直接和間接影響。同理，您也可以開展ChIP-seq，來檢測染色體如何被非編碼RNA所調控。不過，生物學系統充滿了反饋環及互相聯系，因此，這些高通量方法將檢測到許多二級影響。

Kevin White（芝加哥大學）：

準確測定RNA對基因調控影響的唯一方法是通過詳細的生物化學和分子遺傳學實驗。然而，異位表達microRNA或產生microRNA基因的突變體，接著開展表達譜分析，也是產生候選目標的有力方法。這種方法可進一步細化為，結合計算機預測方法或生物化學方法（如RIP-seq），以鑒定mRNA轉錄本中的目標位點。