近日發表在RNA Biology上的研究中，來自中國科學院北京生命科學研究院、動物研究所及中國科學院大學等多家單位的科學家們首次通過5’-Cap捕獲法對蝗蟲的 RNA直接測序，揭示了Piwi 外顯子化模式的廣泛建立以及蝗蟲轉錄組中的轉座子（TEs）對RNA剪接的重要作用。
轉座子（TEs）在后生動物物種中表現出廣泛的轉錄活性，它們的表達受到Piwi 蛋白通過轉錄沉默和轉錄后沉默兩種模式的限制。TEs插入到內含子中被剪切機制識別，當做外顯子添加到RNA轉錄本中的過程被稱為外顯子化，外顯子化TEs包含許多剪接供體和受體位點，這有助于形成可變剪切轉錄本。插入宿主基因的TE外顯子能夠生成新的外顯子可變剪接，這些新的可變剪接可能作用于新的基因，但很少有在全基因組規模上進行TEs的轉錄本研究，這主要由于短讀長測序技術不能夠精準組裝轉錄組或者讀取重復區域。
文章中提到：
準確測定全長RNA轉錄本序列是轉錄組研究的基礎，短讀長高通量RNA測序曾是研究真核轉錄本最流行的方法，它為基因結構的鑒定、新亞型、選擇性剪接和選擇性多聚腺苷酸化提供了重要的工具。然而，目前基于cDNA合成的轉錄方法受限于第一條鏈合成過程中，由于轉錄物的降解和逆轉錄酶的自然效率降低而導致基因結構的5‘端表達不足，因此短讀長測序技術的缺陷限制了其在復雜轉錄本事件如重建包含TE序列的轉錄本異構體等的應用；此外，短讀長測序基于聚脫氧胸苷引物或者隨機六聚體引物，接下來是cDNA的合成。在這一過程中，逆轉錄或擴增可引入偏倚，與總mRNA混合物相比，PCR擴增文庫的復雜性有降低的趨勢，且PCR 擴增重復序列容易生成如重組或者嵌合體的PCR介導偽跡。
最近開發的長讀長測序技術進行cDNA全長測序的方法基于模板轉換反應，依賴于在逆轉錄酶到達RNA5’末端時，添加非模板化的多胞嘧啶尾，這種方法同樣有不足之處，包括模板轉換寡核苷酸時引發非特異性，產生人工嵌合的cDNA，將含有poly-A尾的降解RNA轉化為cDNA等。除此之外，包含在這種測序方法內的反轉錄由于TEs重復序列之間的模板切換，同樣會產生剪切位點偽跡。
因此基于cDNA合成的轉錄組測序方法對含有TE序列的RNA轉錄組測序具有局限性。
納米孔測序技術是由英國Oxford Nanopore Technologies公司研發的新一代單分子長讀長測序技術。其獨特優勢在于，它是一種基于電信號的測序技術，無需通過檢測光或者熒光信號來實現堿基序列的讀取。可以實現對原始DNA或RNA模板進行直接、準確的測序。對于RNA，它能夠用于表征全長轉錄本，識別堿基修飾，以及對異構體、剪接變體和融合轉錄本進行量化和分析，且無測序偏好性。
飛蝗（Locusta migratoria）基因組較大，高達6.5Gb，其中轉座子（TEs）序列占比高于65%，且大部分具有轉錄活性。因此，飛蝗可作為研究大型基因組TE結構和功能的理想模型。該研究組之前用短讀長RNA數據中鑒定出蝗蟲轉錄組的105個TEs，發現其中只有7個是全長形式的TEs。因此研究組通過 5’-Cap捕獲的方法富集全長RNA轉錄本，5’-生物素化的RNA轉錄本通過耦合的鏈霉親和素免疫磁珠捕獲，通過Nanopore對RNA直接進行測序，結果表明
1. 5?-Cap捕獲方法可富集全長RNA轉錄本：RNA轉錄本5?-末端合成的RNA接頭（分為短接頭文庫和長接頭文庫）用作序列標簽評估RNA轉錄本的完整性，短接頭文庫和長接頭文庫分別產生457,470和269,712條高質量reads。
2. 大量的RNA轉錄本包含外顯子化的TEs：以最長的RNA轉錄本作為每個轉錄本單元的代表序列，在60,908條代表序列中，51.88%（31,599）至少包含1個TE衍生序列，TEs序列長度占整個蝗蟲轉錄組的19.94%。
3. Piwi 的表達影響包含TE衍生序列的RNA轉錄本的長度：80%以上包含TE衍生序列的RNA轉錄本被認為是蝗蟲的轉座子，大量的轉座子隨著Piwi 的沉默表達量上調，RNA干擾的Piwi 表達對蝗蟲轉錄組中編碼基因的表達有重要影響。
文章最后提到：與短讀長基于組裝的測序數據相比，納米孔長讀長測序顯示了全長轉錄組測序應用上的優勢，為RNA測序提供了無需組裝片段來解析全長轉錄組的機會。
參考文獻：
https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/15476286.2019.1602437