親和柱層析法提純mRNA

實驗概要

該方法利用mRNA上的寡聚A可與較聯寡聚T的纖維素柱在高鹽下以堿基配對形式發生親和吸附，而在低鹽下，堿基配對能力破壞，吸附解除，而其他成分的RNA則不具該特性，因此在高鹽下當RNA抽提樣品流經該柱時，mRNA被掛在柱上，而其他RNA則隨高鹽溶液流出；當用低鹽洗脫液洗柱時，mRNA隨洗脫液流出。再用有機溶劑沉淀則可得純化mRNA。

主要試劑

柱材Oliga(dT）－纖維素

上樣液：20mM  Tris-HCL(pH 7.6)

          0.5M   NaCL

          1mM   EDTA (pH 8.0)

          0.1%   十二烷基肌氨酸鈉（SLS）

洗脫液：10mM Tris-HCL(pH 7.6)

          1mM EDTA  (pH 8.0)

          0.05% SDS

主要設備

層析系統，水浴，離心機，取液器，分光光度計

實驗步驟

1. DEPC處理層析柱。

2. 0.1M NaOH處理Oliga(dT）－纖維素。

3. 用1×上樣液洗柱至pH< 8.0。

4. 無菌水溶解RNA，65℃溫浴5分鐘后，迅速冷卻至室溫，加等體積2×上樣液，上樣，分部收集。

5. 1倍體積1×上樣液洗柱，分部收集。

6. OD260沉淀收集液，確定收集液的該值是否接近0，如該值仍很大，則上樣液繼續洗柱，直至該值接近0。

7. 2－3倍柱床體積的洗脫液，洗柱，分部收集。

8. 測定各收集管的OD260，將有吸光值的各管合并。

9. 在洗脫液中加入0.1體積的NaAC，1體積的異丙醇，－20℃沉淀過夜，12000g 離心10min，75%乙醇洗沉淀，真空干燥。

10. 提取mRNA質量的分光光度計檢測，將所提mRAN分別在260，280nm比色，要求A：OD260％/ OD280％不小于2.0及40μg所提樣品在OD260％的值為1 .

11. 提取mRNA質量的電泳檢測，在1%的變性膠上，EB染色后，mRNA應在0.5-8Kb間均勻著色，1.5-2Kb間著色較強。