從總RNA中除去基因組DNA實驗

發布時間：2019-03-27 22:55 原文鏈接：從總RNA中除去基因組DNA實驗

為了進行 FDD 基因表達的分析，以及使用任何其他基于 RNA 的基因表達技術，在反轉錄合成單鏈 cDNA 和后續的 PCR 操作之前，必須除掉污染的基因組 DNA。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。

試劑、試劑盒	變性（甲醛)瓊脂糖凝膠瓊脂糖蒸餾水甲醛蒸餾水乙醇甲醛 MOPS 緩沖液乙二胺四乙酸 MOPS 乙酸鈉酚氯仿（3:1) 溶液氯仿液體酚 Tris-HCl 電泳緩沖液
儀器、耗材	離心機和轉頭離心管配膠板微波爐
實驗步驟	一、材料 1. 緩沖液、溶液和試劑變性（甲醛)瓊脂糖凝膠（配制過程見第 18步） 1g瓊脂糖 83 ml 蒸餾水 12.3mol/L甲醛蒸餾水乙醇，100% 乙醇（70%), 用 DEPC 處理過的 H20 配制 12.3mol/L(37%) 甲醛,pH>4.0 10XMOPS 緩沖液 0.01mol/L 乙二胺四乙酸（EDTA) 0.2mol/LMOPS 0.05mol/L 乙酸鈉酚/氯仿（3:1) 溶液 10 ml 氯仿 30 ml 液體酚 10 mlTris-HCl，pH7.0 電泳緩沖液（見第18f. 步） 10 ml10XMOPS 用 900 ml 蒸餾水，稀釋到 1X 濃度 2. 核酸和寡核苷酸來自方案 1 的 RNA 3. 離心機和轉頭 Microfuge(推薦 MocroSpin24，SorvallInstruments，Wilmington，DE) 4. 專用設備 1.5 ml 離心管配膠板微波爐 5. 附加試劑 MessageClean DNA Removal Kit(GenHunter M601), 包括 10X 反應緩沖液、無 RNA酶的 DNA 酶 I(10U/ul)、3mol/L 乙酸鈉、焦碳酸二乙酯（DEPC) 處理過的 H₂0、RNA 點樣混合液二、方法 1. 用 DNA 酶 I 消化總 RNA （1）如果必要，用 DEPC 處理過的 H₂0 稀釋所需量（最多 50ug) 的待消化 RNA, 最大體積為 50ul。（2）在一個 1.5 ml 的離心管中，按順序加入下列成分（總反應體積為 56.7ul)。總 RNA50ul 10X 反應緩沖液 5.7ul DNA 酶 I(10U/ul)1.0ul （3）輕柔地混勻，并在 37°C 溫育 30 min。 2. 抽提和乙醇沉淀無 DNA 的 RNA （4）在購買時提供的玻璃儲存容器中，將苯酚晶體加熱至 65°C 熔化，用來配制酚/氯仿溶液。（5）將 30 ml 熔化的酚加到 10 ml 氯仿中，并混合均勻。（6）加入 10 mlpH7.0 的 Tris-HCl，混勻，使其在使用前形成飽和相。（7）在每個 DNA 酶 I 反應的 1.5 ml 離心管中，加 40ul 酚/氯仿溶液，渦旋混勻 30s。（8）將溶液置于冰上 10 min。（9）以最大轉速 4°C 離心 5 min。（10）收集上清液，將之轉移到一個干凈的、標記好的 1.5 ml 離心管中。（11）加入 5ul3mol/L 乙酸鈉和 200ul 100% 乙醇，混勻。（12）將混合液在-80°C 放置 lh 以上。（13）以最大轉速 4°C 離心 10 min，沉淀 RNA。（14）小心地除去上清液，用 0.5 ml70% 乙醇（用DEPC 處理過的出 0配制）洗滌 RNA沉淀。不要將沉淀攪起。（15）以最大轉速 4°C 離心 5 min, 并除去上清液。再短暫離心一次，除去殘留的液體，但不要攪動沉淀。（16）用 10~20ulDEPC處理過的H2O 重新懸浮 RNA。 3.RNA 定置與完整性檢測（17）用蒸餾水將無 DNA 的 RNA 樣品按 1:1000 稀釋后，測定 OD₂₆₀。（18）按照下面的方案，制備變性（甲醛）瓊脂糖凝膠。 a. 將下列成分加到可以在微波爐中使用的容器里。 10XMOPS 10 ml 瓊脂糖 1g 蒸餾水 83 ml b. 微波加熱大約 3 min, 使瓊脂糖熔化。 c. 將瓊脂糖冷卻至 50°C 以下。 d. 加入 7 mll2.3mol/L(37%)甲醛溶液，輕輕混勻。 e. 將膠倒入準備好的配膠板中，重新放好梳子。 f. 用 900 ml蒸餾水將 100 ml 10XMOPS 稀釋成 1X 的濃度，制備電泳緩沖液（1L)。用電泳緩沖液將瓊脂糖凝膠浸沒。（19）按照下面的方案，溶解 2~3ugDNA 酶消化前和消化后的 RNA 樣品，與 RNA 點樣混合液混合，在 7% 甲醛瓊脂糖凝膠上檢測 RNA 的完整性。 a. 取 1~10ul(2~3ug)RNA, 加到 20ulRNA 點樣混合液中，在 1.5 ml 離心管中混勻。 b.65°C 溫育10min。 c. 短暫離心，收集冷凝水。 d. 將樣品放置冰上 5 min。 e. 將樣品全部加到 RNA 膠上。 f. 以 50~60V 電壓跑大約 45 min，或者到核糖體亞單位能夠分辨為止。（20）在變性膠上，核糖體亞單位會出現明顯的條帶。在提取或 DNA 酶處理過程中，被降解的 RNA 會呈現彌散的一片。所分析的生物不同，核糖體亞單位的大小也不同。

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