代謝工程改造大腸桿菌實現O乙酰高絲氨酸的高效合成

　　L-甲硫氨酸是一種重要的含硫氨基酸，廣泛應用于飼料、食品、醫藥以及化妝品等領域，年需求量超過200萬噸。目前，甲硫氨酸主要通過化學合成的方法進行生產。隨著能源和環境危機的日益嚴峻，利用環境友好的微生物發酵法合成L-甲硫氨酸的研究越來越受到關注。O-乙酰高絲氨酸(OAH)是合成L-甲硫氨酸的重要前體，能夠在乙酰高絲氨酸巰解酶的作用下直接與甲硫醇反應生成L-甲硫氨酸。基于上述工藝路線，一種偶聯發酵-酶轉化的工藝路線已被開發應用于L-甲硫氨酸的工業生產中，并具有較高的產率。在該工藝中，通過發酵法合成OAH是制約L-甲硫氨酸生產和降低成本的關鍵因素之一。此外，OAH還可用于其他高附加值產品如丁內酯等的生產，是一種有前途的平臺化學品。

　　中國科學院天津工業生物技術研究所研究員劉君帶領的微生物生理和代謝工程研究組和研究員江會鋒帶領的新酶設計與酵母基因組工程研究組進行合作，通過結合代謝工程和蛋白質工程的方法，系統地改造大腸桿菌，實現了OAH的高效合成。在研究中，首先比較了兩種不同來源的高絲氨酸乙酰轉移酶(MetX)，然后通過敲除競爭和消耗途徑基因(metA，metB和thrB)并過表達合成途徑基因(thrA，metxlm)，實現了OAH的積累，其產量達到1.68 g/L。為了進一步提高OAH的生產，該研究采用多種代謝工程策略對工程菌株進行進一步改造，包括：敲除賴氨酸競爭途徑基因lysA；利用啟動子工程調控ppc表達以增強草酰乙酸的供給；比較不同來源的天冬氨酸激酶，促進前體天冬氨酸的合成等，使OAH的產量提高至4.69 g/L。然而，中間代謝產物高絲氨酸的大量積累說明其下游途徑關鍵酶MetXlm的催化能力是不足的。為了解決這一問題，該研究分別采用基于進化保守性和基于結構信息的蛋白質工程策略對MetXlm進行改造，獲得的突變體酶活比野生型提高了12.15倍并受到更少的反饋抑制。通過優化表達MetXlm突變體，使工程菌株OAH產量達到7.37 g/L。隨后該研究通過過表達胞內乙酰CoA合成途徑，調控胞內NADPH的合成，進一步提高OAH的合成能力。最終獲得的工程菌株OAH-7在7.5 L發酵罐中經60 h發酵能夠生產62.7 g/L的OAH，是目前報道的最高水平。

　　該研究獲得國家自然科學基金、天津市自然科學基金的支持，相關研究結果已發表于ACS Synthetic Biology 雜志。天津工生所博士生魏亮為論文第一作者，劉君和江會鋒為論文的共同通訊作者。