| 實驗步驟 |
一、材料
1.緩沖液、溶液和試劑
1XPBS(用于組織培養細胞）
將下列試劑溶解于1L消毒的去離子水中，高壓滅菌。1XPBS的pH應為7.4。
Na2HP04 1.15g
KH2P4 0.2g
NaCl 8g
KC1 0.2g
2.酶和酶緩沖液
（1）消化液MasterMix(用于組織和小鼠尾）
每個組織樣品應與下述成分混合。
核裂解液 200ul
EDTA(0.5mol/L) 50ul
蛋白酶K(20mg/ml) 20ul
RNA酶A溶液（4mg/ml) 5ul
（2）蛋白酶K(20mg/ml溶液；用于組織和小鼠尾）
用無核酸酶的水重懸蛋白酶K至濃度為20mg/ml,然后根據一次預處理的平均樣品數量將其按工作體積進行分裝。-20°C儲存，使用前在冰上融化，要避免多次凍融。
3.特殊設備
3臺單位置的實驗用自動定位器（BeckmanCoulter)
4套P250盒裝吸頭（BeckmanCoulter)
4X4位實驗用自動定位器（BeckmanCoulter)
96孔吸頭洗漆自動實驗用定位器（BeckmanCoulter)
黏性平板密封條（金屬箔制成的）
加熱和冷卻自動實驗用定位器（BeckmanCoulter)
液體處理自動機械（用于自動程序），如BiomekFx或Biomek2000實驗自動工作平臺(BeckmanCoulter)
回旋振蕩式自動實驗用定位器（BeckmanCoulter)
吸頭裝卸自動實驗用定位器（BeckmanCoulter)
Vac-Man96真空裝置（Promega)
能產生15~20in(lin=2.54cm)汞柱壓力的真空泵
真空廢物收集裝置（1L規格）
真空管
水浴，55°C
4.其他
WiZardSV96基因組DNA純化系統（Promega;該系統包括結合扳、96孔深孔板、DNA洗脫板、核裂解溶液、0.5mol/L EDTA、Wizard SV裂解緩沖液、WizardSV洗滌液、RNA酶A溶液和無核酸酶的水）
5.細胞和組織
用于基因組DNA純化的樣品（小鼠尾剪取物、動物組織或組織培養細胞）
二、方法
1.用于自動純化DNA的小鼠尾樣品和組織裂解液的準備
（1）將一個0.5~1.2cm長的小鼠尾剪取物或20mg的其他組織置于96孔深孔板的每孔中。20mg組織是允許的最大樣品量，超過此置可能導致純化過程中SV96結合扳充塞8
（2）每個樣品加入275ulMasterMix消化液后，用黏性密封條封上板。
（3）將該板置于55°C水浴中溫育過夜（16~18h)。
如果在蛋白酶K過夜消化后不立即逬行基因組DNA的純化，則可以將樣品裂解液凍于-70°C儲存。
在對基因組DNA進行自動純化操作前，必須將冰凍的裂解液升溫到55°C且保持lh。
可選：如蛋白酶過夜消化后仍有未消化的毛發和軟骨殘存，可以在2000g下離心該96孔板來沉降未消化的樣品，然后將上清液轉移到一個新96孔深孔板中。
2.從組織裂解液中自動純化基因組DNA
樣品組織由蛋白酶K消化后，接下來的所有基因組DNA純化步驟都可以在一個液體處理工作平臺中自動進行。把需要的工具、試劑和溫育的組織裂解液板放置于自動液體處理器的工作臺上后，將自動進行以下操作。
（1）每個樣品孔中加入250ul Wizard SV裂解緩沖液。
（2）抽吸數次以混合各孔內的成分。
（3）將組織裂解液轉移到置于其空裝置中的結合板的孔內，通過抽其空使所有裂解液過結合板以使基因組DNA結合到板上。
（4）向每個結合板的孔內加入1ml Wizard SV洗滌液。
（5）通過抽真空使洗滌液通過結合板。
（6）重復步驟（4）和（5）以使總洗滌次數達到3次。
（7）在濾孔抽空后，繼續抽真空6min以干燥結合基質。
（8）準備其空裝置組裝器以進行洗脫。取出其空裝置內的結合板，放入一個深孔洗脫板,然后將結合板以相同的方向置于洗脫板上，這樣結合板的尖端就位于深孔洗脫板的中央。
（9）向結合板的每個孔中加入200ul無核酸酶的水（室溫），且在室溫下溫育2min。
（10）抽真空lmin將已純化的基因組DNA從SV96結合板中洗脫到96孔深孔板中。
（11）重復步驟（9）、（10）使總洗脫體積達到400ul。
（12）基因組DMA純化結束，純化好的樣品在96孔深孔板中。用平板密封條封好板后，樣品可在-20°C或-70°C儲存。
3. 從組織培養細胞中自動純化基因組 DNA
下面的程序用于從 96 孔培養板中培養的組織培養細胞中自動純化基因組 DNA。每個孔
最多可以純化 5X106 個細胞，如果每孔中細胞的數量超過這個值就可能會引起純化過程中 SV96 結合板的充塞。細胞數目可以根據細胞類型和功能進行調整。
（1）自動純化前要用消毒的 1XPBS 對細胞進行一次洗滌，隨后的所有步驟都可以在一
個液體處理工作平臺中自動進行。把需要的工具、試劑和細胞（無介質或 PBS) 置于自動液體處理器的工作臺上后，將自動進行以下操作。
（2）向已洗滌的細胞中加入 150ul WizardSV 裂解緩沖液，抽吸混勻。
如果基因組 DNA 不立即進行純化，可在加入 WizardSV 裂解緩沖液后伴止該步的進行，樣品可儲存于-70°C。將樣品裂解產物融化后，可按照步驟（3）繼續進行基因組 DNA 的純化。
（3）轉移細胞裂解液到其空裝置中的結合板內，通過抽真空使洗滌液通過結合板，從而
將基因組 DNA 結合到結合基質上。
（4）向結合板的每個孔中加入 lml 洗滌液，抽真空使洗滌液通過結合板。
(5)重復步輾(4)兩次，使洗滌的次數達到3次。
(6)在濾孔抽空后，繼續抽真空6min以干燥結合基質。
(7)準備真空裝置用于洗脫。取出結合板，在真空裝置中放入一個深孔洗脫板，然后將結合板以相同方向置于洗脫板頂上，使結合板尖端位于深孔洗脫板中央。
(8)向結合板的每個孔中加入200ul無核酸酶的水（室溫），室溫下溫育2min。
(9)抽真空lmin使已純化的基因組DNA從SV96結合板中洗脫到96孔深孔板中。
(10)基因組DNA純化結束，純化好的樣品在96孔深孔板中。用平板密封條封板，樣品可在-20°C或-70°C儲存。
RNA可能與基因組DNA—起被純化出來。為除去純化出的RNA,在由濾柱中洗脫基因組DNA前應該向250ul無核酸酶的水中加入2ulRNA酶A溶液。洗脫后，室溫下將已純化的基因組DNA溫育l0min。或者也可以在洗脫后加RNA酶A溶液（2ul)。
4.分離DNA的定性和定量
WizardSV純化樣品的產量和質量可以通過用分光光度計對A260和A280進行分析來確定。根據樣品的來源情況（表9-2)，高分子量的基因組DNA通常的產量為5~20ul,且A260/A280的值為1.7士0.08。圖9-4給出了用Biomek2000自動機械工作平臺處理的單個小
鼠尾樣品的產董和質量。同時，對純化的基因組DNA在PCR擴增中的模板效用也進行了評估。從小鼠尾和組織培養樣品中純化的基因組
DNA 中取 1ul 來進行 PCR 擴增，其中小鼠尾樣品是用白介素-1(3(IL-lβ) 特異引物的擴增來評估的，而從 HeLa
細胞中分離的基因組DNA 是用 FactorVDNA 特異引物的擴增來評估的（圖 9-5)。
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