這是我收集的SP分選的方法：與大家共享。
一 Hoechst染色方案
1. 在37℃循環水浴箱中預熱DMEM+培養基。確保溫度為37℃。
2. 重懸細胞于預熱的DMEM+培養基中，濃度為106/ml，為了避免細胞留在試管中，所以在Hoechst染色時必須用聚丙烯試管。當要染大量細胞時，在250ml聚丙烯試管中最為便利。
3 加入Hoechst至終濃度為5μg/ml。我們建議用200 的原液(1 mg/ml)，它是將一整瓶Hoechst粉末溶于水中(B2261, Sigma)，再分裝，保存濃縮的Hoechst溶液在－20℃
4 將細胞在37℃循環水浴箱中預熱，在90 min 的孵育中定期混勻試管。時間和溫度對于Hoechst染色來說特別關鍵，所以DMEM必須預熱而且試管必須完全沒于水面。
5 Hoechst染色完成后，細胞必須處于4℃以防止Hoechst繼續外排, 絕不能加有Ficoll或其他別的延長高溫的程序，因為這些可以導致非干細胞的其他細胞的染料外排，最終導致真正SP細胞的純度降低。細胞4℃離心，并重懸于冰的HBSS+。
6 抗體的染色這時可以在冰上進行。為了保證干細胞的純度，加入干細胞特異性抗體，其濃度取決于參考各自的滴度，或廠家提供的說明書。所有的染色和離心必須是4℃。
7 當用FACS分析細胞時，重懸細胞于冰的HBSS+，同時加入 2μg/ml PI 以區分死細胞，盡管PI染色在ＳＰ并不完全需要，但還是強力推薦。Hoechst對有些細胞有毒，PI可以分出死細胞，使Hoechst發散圖更簡化。
8 試劑
DMEM+ ：高糖DMEM (Cat No. 11965‐092, Gibco Invitrogen)
Penicillin/streptomycin (Cat No.15140‐122, Gibco Invitrogen)
10 mM HEPES（羥乙基哌嗪乙磺酸） (Cat No. 15630‐080, Gibco Invitrogen)
2% Fetal bovine serum/fetal calf serum
HBSS+ ：Hank’s平衡鹽溶液(Cat. No. 14170‐112, Gibco Invitrogen)
10 mM HEPES（羥乙基哌嗪乙磺酸） (Cat No. 15630‐080, Gibco Invitrogen)
2% Fetal bovine serum/fetal calf serum
Hoechst 33342粉 (Cat. No. B2261, Sigma)：200×原液(1 mg/ml) 的制備，將Hoechst 33342粉溶于過濾除菌的蒸餾水中 ，Sigma公司的Hoechst 33342粉剛好可以得到500ml溶液，強力推薦一次性將Hoechst 33342粉立即溶解，然后用每ml分裝凍存。凍融的Hoechst份盡量少的再凍，以免使水分增加。
（PI）Propidium iodide (Cat. No. P‐4170, Sigma):工作濃度為100×（200μg/ml）溶于ＰＢＳ，并用鋁箔紙遮蔽，重懸于HBSS+終濃度為2μg/ml。
二 Hoechst－染色細胞的抗體染色法和磁珠濃縮法方案
1 Hoechst染色結束后，重懸細胞于1×108 cells/ml 冰的HBSS+，在冰上將生物素酰化的抗體與細胞共孵育10min。（抗體的稀釋劑滴度按說明書進行）
2 用10倍體積的HBSS+洗去未結合的抗體，在低溫離心機中離心。
3 用磁珠小體標記細胞，從Miltenyi Biotech (Cat. No. 130‐090‐485)得到抗生物素磁珠小體。將細胞與20% 體積的磁珠小體在4℃條件下共孵育15min。我們發現，如果在冰上孵育，則磁珠與抗體標記細胞的效力會下降。還是在4℃冰箱中孵育較好。
4 用10倍體積的HBSS+沖洗細胞，在低溫離心機中離心。
5 重懸細胞于2×108 cells/ml于冰的HBSS+，細胞調整至流式細胞儀分析所需的容器。
三 Hoechst SP細胞的流式細胞儀分析
1 Hoechst 33342的激發：要觀察到ＳＰ，必須用紫外激光器來激發Hoechst 33342 染料和PI。紫外激光也會有較好的效果(Simpson et al., 2006)。Hoechst在350 nm波長被激發，另外的激光如激發FITC 和PE 的488激光可以用來激發其他的熒光染料。
2 Hoechst發散的探測：Hoechst染料的發散用兩個探測器來測量：Hoechst Blue和 Hoechst Red。Hoechst Blue用450/20濾光片測量，Hoechst Red用675LP濾光片測量。用一種分色鏡（我們用610 DMSP）來分離發散波長，PI熒光亦用675LP通道來測量。但他的陽性信號要較Hoechst Red信號更亮。可以用488激光同時激發和發散PI，用來將死細胞從發紅色熒光的活的Hoechst染色的細胞中分離出來。同時，別的濾光片也可以應用，但這里推薦的是做好的。
還有，一種高能的紫外激光(50–100 mW)可以最好的分選SP。低能也許夠用，但群不一定很清楚。最關鍵的是，SP可以被其阻斷劑—維拉帕米，一種抗體共染，特異性的針對SP鑒定。
3 流式細胞儀分析：Hoechst熒光顯示為Hoechst BLUE 對 RED散點，BLUE在Y軸，RED在X軸，都是線性，電壓調整后，紅細胞在左下角，PI染色+的死細胞Y軸的極右端，多數細胞在中心位置，或右上方。也有可能檢測到一大部分 G0–G1及 S–G2–M cells 在右上方。
為了能看到SP細胞，畫一個取樣門將紅細胞和死細胞排除，一個未濃縮的骨髓細胞樣本，取樣門可以有50,000–100,000細胞需要SP鑒定。SP區要像圖示來畫。對于一個未濃縮的鼠骨髓標本來講，SP細胞的數量大約為0.01%–0.05%，SP細胞在正常的鼠骨髓細胞顯著的大于這個‐0.05%提示Hoechst的弱染色而受非SP的污染。這完全可以想象，SP細胞中有一些細胞不表達經典的造血干細胞表面標志。如果染色進行的適當，SP細胞的65 —95% 會有經典的造血干細胞表面標志，這些可以用來純化側群細胞。
4 操作FACS的要點：Hoechst的發散是呈線性的，好的CVs對于SP鑒定至關重要。要保持好的CVs，重要的就是要用能緊密地分布線性樣式的顆粒 (DNA check beads, Coulter)來校準。另外，低的樣本分壓同樣重要。最大的樣本分壓不能快于用校準顆粒校準的定標。骨髓細胞可以較高濃度來分析，以保持低樣本分壓。
5 好的SP染色的證實
（1） 共孵育維拉帕米處理過的對照來確保SP 可被清除。在Hoechs染色的整個過程中加入終濃度為50μM的維拉帕米，經維拉帕米處理后，SP細胞可以被阻滯。
（2） 用抗體共染色：SP細胞里富含干細胞，好的Hoechst染色中60%–80%的SP細胞為干細胞表面標志物陽性細胞。