免疫學技術專題：雌二醇的免疫膠體金試紙法檢測

雌二醇(17β-Estradiol)是天然雌激素的重要成分，為防止兒童性早熟等問題，食品中尤其是畜禽產品的雌二醇檢測不容忽視。膠體金免疫層析技術(GICA)在檢測小分子有機物方面越來越受到重視。其基本原理是膠體金顆粒能夠穩定吸附蛋白質，而蛋白質的生物活性無明顯變化，所以它可以取代酶標記抗體〔1，2〕。本實驗采用標記有雌二醇單克隆抗體的膠體金顆粒與相對應的固定在硝酸纖維膜上的雌二醇結合物相結合，固定有雌二醇結合物的檢測線處就顯現明顯的顏色〔3，4〕。本法具有靈敏度高、特異性強、簡便快速、成本較低、結果容易判讀等優點，適用于樣品的初步篩選。

一、材料與方法

1、試劑與儀器 氯金酸(上海化學試劑廠)；牛血清白蛋白、卵清白蛋白、兔抗鼠多抗(天津聯星生物公司)；雌二醇標準品、雌二醇單抗、17β-Estradiol-6-one6-(o-carboxymethvyoxime)美國Sigma公司)；其他試劑均為國產分析純。硝酸纖維膜、玻璃纖維膜（美國Millipore公司)；Beckman Du530分光光度計(德國Beckman公司)；低溫高速離心機(軍事醫學科學院）；點膜機(美國Bio-Dot公司)。

2、方法

（1）膠體金的制備 用三蒸水溶解氯金酸，使其終濃度為01g／L.先進行沸水浴，待氯金酸溶液煮沸后，每100ml加入1％檸檬酸三鈉25ml，再沸水浴下快速攪拌，直到氯金酸溶液的顏色穩定，繼續沸水浴10min〔5〕，冷卻至室溫后，用透射電鏡鏡檢并用分光光度計檢測顆粒均勻度及粒度。最后置于4℃冰箱保存備用。

（2）最適標記蛋白量的確定 用02mol／L K2CO3將膠體金溶液調至pH為82，然后取試管9支，分別加入10ml膠體金溶液。將雌二醇抗體逐級稀釋后，各取等體積稀釋液順序加入上述試管中，混勻，另設一不加抗體的對照管。放置10min，在各管中加入01ml的10％NaCl，混勻后靜置2h.觀察各管中膠體金溶液變化，未加蛋白及加入量不足的溶液顏色由紅變藍，而加入蛋白量達到或超過時的溶液則保持不變。標記蛋白量即為最低穩定膠體金溶液不變色的蛋白量基礎上再加20％。

（3）膠體金探針的標記 將抗體用0005mol NaCl溶液透析過夜，離心除去蛋白沉淀，調至05mg／ml.取膠體金100ml，用0，2mol／L K2CO3將膠體金溶液調至pH為90，磁力快速攪拌下緩慢加入24ml稀釋的雌二醇抗體，繼續攪拌10min，加入牛血清白蛋白(BSA)，使其最終濃度為1％，再攪拌10min.將初步制得的膠體金探針以4000r／mm離心20min；棄沉淀，上清以10000r／min離心60min；棄上清，沉淀用001mol／L的磷酸鹽緩沖液(PBS)(含1％牛血清白蛋白)重新懸浮；同前離心洗滌2次，將沉淀用001mol／L的PBS(pH82，含1％BSA，002％NaN3)懸浮，4℃保存備用。

（4）抗原的合成 小分子物質難以固定在硝酸纖維膜上，只有使它連上大分子物質才能較好地固定。本實驗采用混合酸酐法制備完全抗原。雌二醇-6-肟43mg,加入三正丁胺50μl,二氧六環4ml，冰浴冷卻到10℃以下，加入氯甲酸乙酯15μl〔6〕。4～10℃下反應30min.配制卵清白蛋白(OVA)溶液(OVA 10mg，3ml水，3ml二氧六環，1mol／L氫氧化鈉03ml)。將配制好的OVA溶液加入反應液，4℃冰浴攪拌6h，反應過程中，用氫氧化鈉維持pH值為8.反應完畢后，將反應液加入透析袋，透析2d.將透析液調至pH45，冰箱4℃，放置4天，有黃色沉淀出現。離心收集沉淀，冷凍干燥，4℃冰箱保存。將OVA溶于透析液內作為參比，用紫外光譜法對雌二醇-6肟-OVA進行定性檢驗。經紫外測定證明蛋白質已與雌二醇衍生物結合。

（5）膠體金免疫層析試紙條制備 測試條由玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、加樣紙、吸水紙4部分組成。將玻璃纖維膜裁成6mm的細條，然后放入含1％BSA、1％Tween-20的PB液中浸泡30min，37℃烘干，最后將膠體金探針灌注已處理好的玻璃纖維膜上，真空干燥備用。在硝酸纖維膜上用點膜機將上述抗原和兔抗鼠IgG噴成2條線，分別為檢測線和對照線，經真空干燥后，用1％BSA、001mol／L PBS（pH90)封閉2h，以001mol／L PBS洗滌，再真空干燥。將30mm吸水紙、25mm硝酸纖維膜、6mm玻璃纖維膜、15mm加樣紙，由頂部依次粘于PVC板上，裁成細條備用。

（6）檢測與判讀 樣品：含已知濃度雌二醇樣品的乙醇溶液分為3組，第1組不加雌二醇，第2組為02μg／ml雌二醇，第3組為04μg／ml雌二醇。將加樣紙一端插入待測液，濕潤后取出，水平放置，約3～5min，觀察結果。如試紙條硝酸纖維膜上僅對照線呈一條紫紅色帶為陽性；如出現2條紫紅色帶為陰性；如質控線不出現紫紅色帶，無論檢測線是否出現，測試結果均無效。