免疫層析——也來談談膠體金

如果說膠體金免疫層析，估計大家都不知道。如果說，早早孕，那大部分人都會，oh，兩條杠啊。放圖：


這就是早早孕試紙條，純潔的小朋友也不用害羞，這是科學討論，早早孕是膠體金免疫層析試紙條里的明星，適齡青年基本均略有耳聞，更有甚者耳熟能詳。小編就是耳熟能詳的的那一類人，不要誤會，小編也只是研究它而已，天天和此技術打交道，做的是病毒檢測······，是的，艾滋病毒檢測，怕了吧。

20世紀90年代末，膠體金標記被引入膜快速檢測中，在適當生產條件下，任何精確大小的金顆粒都可以被重現性制造出來。不同的大小可用于不同的用途。當膠體金被大量生產時，為了保證重復性和穩定性，成熟的方法和工藝是必須的。為了獲得粒徑均一且單分散型的膠體，目前市面上合成膠體金的有很多種，盡管所有方法都是依賴于還原HAuCl4來形成金原子，但其物理條件還是有相當大的差異。通常使用的還原劑有檸檬酸三鈉、黃磷、硼氫化鈉、硫氰酸鈉等。

那現在就來談談小編的經驗了。
第一，需要保證器皿的潔凈度，通常情況下，會對所有需要接觸到膠體金的器皿使用王水或重鉻酸鉀洗液浸泡過夜，使用純凈水沖洗干凈后，多次使用高純水沖洗，再烘干，此時的器皿就是潔凈的且不含任何陰陽離子了。有部分科研人員會對器皿進行硅化處理，在器皿表面鍍上一層硅，使用5%的二氯二甲基硅烷對玻璃器皿進行浸泡處理后烘干，即為硅化處理了，此方法同樣是為了防止玻璃器皿內殘留的陰陽離子對實驗造成影響。

第二，就是制備膠體金了，我們實驗室使用的是檸檬酸三鈉，又稱鞠酸化鈉，相比于其他的還原劑，它安全可靠且穩重。常規的制備方法是：配置0.01%的氯金酸水溶液，封住容器口，攪拌子攪拌混勻加熱，直到接近沸騰的溫度時，一次性加入一定體積的1%的檸檬酸三鈉溶液，保持低速攪拌（盡量降低液體蒸發速度），繼續加熱，可見反應容器內液體由淡黃色-淡紫色-黑色-酒紅色。最后達到穩定的酒紅色后，繼續加熱5min，關掉熱源，冷卻至室溫，即為制備好的膠體金。操作所有過程，使用的都是高純水。

第三，1%檸檬酸三鈉的體積與0.01%氯金酸的體積的比例不同，制備出的膠體金的粒徑也不相同。常規的1.5mL/100mL可制備出的膠體金的粒徑在40nm左右，當然，這和每個人配置的試劑濃度標準性也有關。隨著還原劑體積的增加（也就是檸檬酸三鈉溶液體積的增加），制備所得的金原子的粒徑會越來越小。通常情況下，制備了膠體金后，我們會通過電鏡掃描確定所制備得到的金原子粒徑大小及均一度。



下面是膠體金形成過程介紹圖：

大體來說，就是還原劑提供給溶液中帶正電荷的金離子而產生金原子：
氯金酸+還原劑=膠體金
HAuCl4+e-=Au0

加入還原劑之前，溶液中所含為100%金離子。曲線的縱坐標代表加入還原劑后金粒子轉化成為金原子的過程。加入還原劑后，溶液中金原子的含量立刻出現急劇上升，直至達到飽和。緊接著在一個被稱為核化的過程中發生凝集作用，在核化位點形成由11個金原子構成的二十面體金核心。金原子可以沿著金核心聚集，長成不同粒徑的膠體金。最初形成的核數目，決定了最終將有多少顆粒形成于溶液中，而此數目又反過來取決于所加入的還原劑的量。還原劑越多，產生的晶核也越多從而產生的金顆粒也越多。

顯而易見，在一個含既定數目氯化金的溶液中，形成的核化位點數目越多，最終形成的每個金顆粒的尺寸就越小。因此，微粒大小可通過所加入的還原劑的量來精細調控。當條件通過優化，所有的核化位點都可以在瞬間同時發生，從而使得所形成的金顆粒大小完全都一致（單分散型）。一般情況下，還原可以瞬間發生，而核化要同時瞬間發生是很難的，這就導至生產均一度高的膠體的難度。

若在還原過程中核化作用及形成速度沒有得到很好的控制，粒子的形成就會不均一，所見粒子可能有不同的大小和形狀（橢圓、三角形、長方形、棱形等等）。這樣的粒子在后續使用中，影響蛋白的結合過程，也不能在溶液中均勻分布，最終影響產品的顏色、敏感性、特異性和穩定性。一般膠體金的好壞與否，通過電鏡能得到最直觀的結果。不過也可從膠體金溶液的形態上辨別。“劣質金”溶液一般會顯得渾濁，顏色不透亮。與之相對應的均一度較高的膠體金，通常顏色透亮，對光有丁達爾效應。

與代表著制作精良的40nm的單分散性膠體粒子的櫻桃紅色相比，由“劣質金”所形成的信號可見到淡藍色或紫色。隨著時間的推移，蛋白很容易和膠體金分離，導至假陽性或者背景變高。因此，為了制備更高質量的膠體金溶液，相關學者都在不斷的進行一系列的研究。目前比較適用的就是回流加熱煮沸法制備膠體金：
第一、同樣是對反應過程的所有器皿進行王水或者洗液浸泡，或者硅化處理。烘干后，用高純水浸泡，再次烘干。
第二、配置0.01%的氯金酸溶液，加入干凈的攪拌子，混勻。
第三、回流圓底燒瓶放置于油浴磁力攪拌器內，加熱至溶液接近沸騰。迅速的一次性加入一定體積的檸檬酸三鈉溶液，繼續恒溫回流，保持沸騰狀態。
第四、觀察溶液顏色變化，由淺黃色—黑色—紫色—酒紅色，顏色穩定時，低速攪拌。停止加熱，冷卻至室溫，即為制備得到的膠體金溶液。

通過此方法制備得到的膠體金溶液，可以降低因為溶液蒸發造成的粒徑不穩定性因素。剪了一段膠體金制備的操作視頻，大家可以參考一下。

除了上述小編提到的兩種方法以外，還有無數種制備膠體金的方法，因為小編沒有試過，也就不再介紹，感興趣的小朋友可以查閱相關文獻后，進行嘗試。