膠體金標記蛋白質的純化

標記好的免疫金探針必須經過純化處理才能用于IHC染色，尤其是免疫電鏡的染色。純化的目的就是除去其中未標記的蛋白質，未充分標記的膠體金及在標記過程可能形成的各種聚合物。其純化方法有超速離心法、色譜柱法以及以上二者相結合應用。

（一）超迷離心法

根據膠體金顆粒大小不同及蛋白質種類不同，離心的轉速和時間也不同。用牛血清白蛋白穩定的膠體金標記羊抗兔IgG,可先從低速離心（20nm顆粒用250g;5nm用4800g20min），棄去聚集的金顆粒所形成的沉淀，然后將上清液5nm金標記物用60000g于4℃離心1h,20nm和40nm金標記物用14000g于4℃離心1h.小心地吸出上清，將管底沉淀再用1%牛血清白蛋白緩沖液混懸至原量，平衡過夜后，重復離心2次，最后一次洗滌離心的沉淀，再用1%牛血清白蛋白緩沖液（含0.02mol/LNaN3）稀釋到l:20.40nm金顆粒在520nm檢驗吸光度為0.35;20nm金顆粒為0.30;5nm金顆粒為0.25,用1%牛血清白蛋白緩沖液作空白。制備的膠體金-蛋白探針可保存于4℃，如加入50%甘油可貯于0℃以下（-18℃）1年以上。

以聚乙二醇穩定的葡萄球菌A蛋白標記膠體金，按膠體金制備方法及所得顆粒大小不同，用不同離心轉速分離純化，以白磷還原法制備的5.0nm膠體金A蛋白，用125000×g離心；抗壞血酸法制備的11.3nm膠體金-A蛋白，用150000g離心45min,可見離心管底部附貼有小片緊密的沉淀，其上為較疏松的紅色沉積物，再上為透明的上清液。附貼管底的沉淀無用，以后操作步驟中不要攪起來，仍保持其貼于管底。棄去上清液后，用等體積的0.0lmol/LPBS（pH7.2）溶解疏松紅色沉積物，同上重復離心1次，小心移去上清液，剩余0.5ml上清液，將疏松紅色沉積物溶解后，即為初步提純的金標-A蛋白試劑。

（二）凝膠過濾法

凝膠過濾法必須以BSA為穩定劑。將前述膠體金-蛋白質復合物裝入透析袋內，置硅膠中濃縮至原體積1/10左右，用蒸餾水沖洗軟化透析袋后，取出濃縮液，以15000r/min離心15min（或用上述離心法純化后的膠體金，再進一步用此方法純化）。吸取上清液加到丙烯葡聚糖S-400（SephacrylS-400,Pharmacia公司產品，Sweden）色譜柱上分離純化。柱床高20cm,直徑0.8cm,加樣體積為柱床體積的1/10.用0.02mol/LTBS液（內含0.1%BSA,0.05mol/LNaN3,pH8.2者用于膠體金標記IgG,pH7.0者用于膠體金標記蛋白A）洗脫，流速為8ml/h,按紅色深淺分管收集洗脫液。可見先濾出的液體呈微黃色，有時略濁，內含大顆粒聚合物等雜質。純化的金標記蛋白濾出液隨濃度增加而紅色逐漸加深，清亮透明，此后為略呈黃色的未標記蛋白組分。表中列出膠體金與蛋白質結合后，用離心法純化的條件。表6-8列出幾種免疫金探針離心純化的條件，僅供參考。

超迷離心轉速與金顆粒直徑的關系

幾種免疫金探針離心純化條件