免疫細胞的檢測方法

用體外或體內試驗對機體的各種參與免疫應答的細胞進行鑒定、計數和功能測定，藉以了解機體的免疫狀態，并對某些臨床疾病的診斷，預后及療效觀察等也具有一定意義。

一、免疫細胞的分離

體外測定免疫細胞首先要從外周血或淋巴組織中分離所需的細胞。其主要方法是根據細胞的表面標記、理化性狀及功能等方面的差別進行設計。常用的方法有密度梯度離心法輔以花環沉降或親合板粘附法(panning)等。目前最先進的方法是用熒光激活細胞分離儀(fluorescenceactivited cell sortor，FACS)可自動、快速和大量地分出各類純度高、活性強的細胞。

(一)外周血單個核細胞的分離

圖18.7 淋巴細胞分離(Fieoll密度梯度法)

主要方法為聚蔗糖泛影葡胺分層液(ficoll hypaque)密度梯度離心法。分離人外周血單個核細胞時，通常將分層液的比重配成1.077，肝素抗凝血置分層液上，于水平離心機2000r/min離心20分鐘，血液中各種細胞因比重不同而被分開(見圖18.7)。此外，分層劑還可選用Percoll、Metrizamid及牛血清白蛋白(BSA)等。分離不同動物血中單個核細胞時，對分離液比重的要求各不相同，如小鼠為1.088，大鼠為1.084，馬為1.090等。

(二)T、B及其他免疫細胞的純化

經密度梯度離心法獲得的單個核細胞是不均一的細胞群，還可根據各種細胞的生物學特性、表面標記等進一步純化。例如單核細胞等具有粘附和吞噬作用，可用玻璃或塑料容器的粘壁法和吞噬羰基鐵顆粒的|檢驗地帶網|磁鐵吸引法除去或獲得。綿羊紅細胞能與人T細胞形成E花環，藉此可通過花環沉降法分離T與B淋巴細胞。此外，利用B細胞具有易粘附于尼龍纖維表面的特性，也可將T和B細胞分開。

為了進一步除去細胞懸液中個別細胞群，尚可將相應的單抗結合于塑料板上，利用親和層析的原理作親和板粘附法，或在細胞懸液中加入單抗和補體，以特異性地破壞相應細胞，使獲得的細胞懸液更加均一。

(三)免疫磁珠分離法

近年來免疫磁珠法應用較多，基本方法是將特異性抗體標記在磁性珠上，當細胞與標記了特異性抗體的磁珠混合后，兩者發生結合，置于磁鐵上，吸取上清中的細胞，即可將所需的細胞分離出來。

(四)熒光激活細胞分離儀分離法

是將熒光標記的抗體與細胞懸液混合后裝入樣品管內，經熒光染色后通過高速流動系統使細胞排成單行，一個個地流經檢測區進行測定。當細胞從流動室噴嘴處流出時，經超聲系統振蕩攪動液流，使液流斷裂成一連串均勻小滴，每小滴最多含一個細胞，在激光束照射下產生熒光和散射光，經光電倍增管接收，轉換成脈沖信號，經電腦處理分辨細胞類型。借助光電效應，當小滴通過電場時可出現不同偏向，即可收集到所需類型的細胞。該儀器能以|檢驗地帶網|5000個細胞/秒的速度高效分離細胞。FACS是集多項功能于一體的細胞分析儀器，除計數細胞外，還可通過熒光染色檢測細胞表面標記、細胞增殖周期、區分細胞活性、分選細胞等。

二、免疫細胞的計數

(一)熒光抗體染色

應用范圍廣泛，可分別使用于B細胞、T細胞及其亞類、MФ及NK細胞的計數及表面標記的測定，多選用間接熒光抗體染色，即活細胞與其特異性單抗作用后再與熒光抗球蛋白抗體反應，經熒光顯微鏡觀察可見膜熒光。

(二)花環形成試驗

T細胞與B細胞皆可應用該試驗進行計數。計數T細胞的方法稱E花環形成試驗(erythrocyte rosette formingcell test，ERFC-T)，即取外周血淋巴細胞與綿羊紅細胞(SRBC)混合，在一定溫度下作用一定時間，使SRBC與T細胞表面的E受體結合，形成以T細胞為中心，繞有SRBC的花環樣細胞集團。B細胞計數的方法有|檢驗地帶網|EA花環形成試驗EAC花環形成試驗，前者將紅細胞(E)與相應抗體(A)結合成EA懸液，再與受試者的淋巴細胞混合，經制片染色后鏡檢，計數花環形成率；EAC花環試驗僅在EA花環基礎上加上補體，使先形成EAC，再與受試淋巴細胞混合。EA和EAC花環試驗分別根據B細胞表面存在著FcγR和補體受體。主要應用于淋巴細胞的分離。

三、免疫細胞功能的測定

(一)T細胞功能測定

1.淋巴細胞轉化試驗(lymphocyte blastogenesis test) T細胞在體外受特異性抗原(舊結核菌素等)或有絲分裂原(pHA、ConA等)刺激后，能轉化為淋巴母細胞。試驗時取外周血或分離的淋巴細胞，加入有絲分裂原或特異性抗原，在培養液中培養72小時，經涂片染色后鏡檢計算轉化百分率。正常人為70％左右，轉化率低表明細胞免疫功能下降。若在培養終止前6小時加入3H-TdR，經β液體閃爍儀檢測淋巴細胞內3H-TdR的摻入量，亦可算出轉化率。由于活的增殖細胞具有|檢驗地帶網|吸收四甲基偶氮唑鹽(MTT)的能力，活化的線粒體能裂解四氮唑環而產生顏色反應，并借助酶標儀于波長570nm下測吸光值作為判斷指標。MTT法簡單易行，常被一般實驗室采用。該試驗可檢測細胞的增殖和細胞毒活性。

2.淋巴細胞參與的細胞毒性試驗(lymphocyte mediated cytotoxicity test，LMC-T) 系檢測CTL的方法。當CTL再次接觸靶抗原時，即表現出破壞、溶解靶細胞的特性。這種特性稱為LMC，檢測時將受試者外周血單個核細胞(效應細胞)與傳代的51Cr標記的腫瘤細胞(靶細胞)按一定的效靶比例混合，于37℃孵育一定時間，離心后用γ計數器測定上清同位素強度，其強度與效應細胞的細胞毒性成正比。按下式計算溶解百分率作為判斷指標。可通過測定腫瘤患者CTL對腫瘤細胞的殺傷力，判斷患者的預后和觀察其療效。

溶解百分率＝(實驗組cpm-自發釋放組cpm)×100％/(最大釋放組cpm-自發釋放組cpm)

3.T細胞功能的體內測定法 在臨床上常用的方法是體內皮試法，細胞免疫功能正常者可出現硬結、紅斑等陽性反應，細胞免疫功能低下者常呈弱陽性或陰性反應。臨床上常作為某些病原微生物感染的診斷和觀察腫瘤患者的細胞免疫狀態、療效、及其預后的指標。①生物性抗原皮膚試驗：分為特異性與非特異性兩類，前者包括以結核菌素(OT)、純蛋白衍生物(PPD)及鏈激酶-鏈道酶(SK-SD)等為抗原的皮膚試驗，其中以舊結核菌素皮膚試驗應用最為普遍。定量注射上述抗原于前臂屈側皮內，24～48小時觀察結果，局部出現紅腫，硬結者(＞0.5cm)為陽性。后者多用有絲分裂原如植物血凝素(PHA)作皮膚試驗，一般在注射后6～12小時|檢驗地帶網|局部出現紅斑、硬結，24～48小時可達高峰，硬結大于1.5cm為陽性。在特異性抗原皮試中，若受試者從未接觸過所試抗原，則多不出現陽性反應，因而往往作兩種以上抗原皮試，以對受試者的細胞免疫功能作出綜合評價。②化學性半抗原皮試：此類半抗原常用二硝基氯苯(DNCB)和二硝基氟苯(DNFB)，皆系小分子物質，進入皮膚后即與組織蛋白結合，構成完全抗原并引起遲發型超敏反應。試驗時先將受試者致敏，即將1％DNCB或DNFB丙酮溶液涂于前臂皮膚，24小時后洗去并于2~3周后再以小劑量DNCB或DNFB涂于同側或對側皮膚，以24~48小時后發生紅腫、硬結、水泡或潰瘍為陽性。細胞免疫功能低下或缺陷者，常呈弱陽性或陰性反應。但由于局部反應較大，病人難以接受。

(二)B細胞功能的檢測

1.空斑形成細胞(plaque formingcell，PFC)檢測 是體外檢測B細胞功能的一種方法。該法最早用于實驗動物的PFC測定。是以SRBC作為抗原免疫小鼠，從免疫小鼠脾臟分離淋巴細胞或直接用脾細胞，將其與高濃度SRBC混合于瓊脂中，經37℃，5％CO2溫育后，在補體參與下抗體形成細胞周圍的SRBC溶解而形成溶血小區，即溶血空斑(plaque)。一個空斑代表一個抗體形成細胞，空斑的數量表示抗體形成細胞的多少。IgM參與本反應，固定補體能力強，可直接激活傳統途徑，導致SRBC溶解，稱直接法。若檢測其他類別免疫球蛋白的抗體形成細胞，需在試驗系統中加入相應的|檢驗地帶網|第二抗體才能使SRBC溶解形成空斑，稱間接空斑形成試驗。近年來，已應用SPA致敏的SRBC結合抗人球蛋白來檢測人的抗體形成細胞，此法稱SPA-SRBC溶血空斑試驗。在此檢測系統中加入抗人Ig，能與受檢細胞產生的Ig結合成復合物，并通過復合物中抗人IgFc段與致敏SRBC上的SPA結合，激活補體而使SRBC溶解。空斑形成細胞的檢測，有助于免疫應答動力學的研究和探討藥物對機體免疫狀態的影響。是目前研究B細胞抗體產生功能的重要手段。

2.定量溶血分光光度法(quantitative hemolysis spectrophotometry，QHS) 該法又稱B細胞介導的紅細胞定量溶血分光光度法，是根據溶血空斑試驗的原理衍化而來，可用以測定由B細胞產生和分泌的抗體裂解紅細胞所釋放的血紅蛋白(以吸光值表示)，從而反映機體的體液免疫功能。試驗時，將免疫的脾細胞與SRBC及新鮮豚鼠血清等體積混合，于37℃水浴1小時，離心后測上清吸光值，其與產生抗體的量成正比。

3.ELISA-空斑試驗(ELISA-plaque assay) 又稱酶聯免疫斑點試驗(enzyme linked immunospot，ELISPOT)。該法與ELISA不同之處是，加入的待檢標本是細胞，而非可溶性物質；所使用的底物可形成不溶性終產物。ELISPOT不僅可應用于B細胞分泌抗體功能的測定，也能檢測分泌細胞因子的T細胞和巨噬細胞。現已有應用該技術于計數類風濕因子分泌細胞的報道，但尚未在臨床推廣。

(三)其他淋巴細胞功能的檢測

1.NK細胞活性測定 包括兩個方面：一是NK細胞的自然殺傷活性，另一是ADCC活性。

①NK細胞的自然殺傷功能的檢測。NK細胞的功能無需抗原或有絲分裂原的刺激，亦不依賴抗體或補體。其測定方法主要是體外同位素釋放法。試驗時將分離的淋巴細胞與51Cr標記的敏感靶細胞(K562)共育于37℃4小時，離心取上清用γ計數器測放射性強度，其與NK細胞活性成正比。②ADCC試驗。有以下兩種方法。第一空斑形成法：是將雞紅細胞在|檢驗地帶網|經多聚L-賴氨酸處理過的玻片上形成單層細胞，加入一定量的抗雞紅細胞抗體及人淋巴細胞，作用一定時間后，由于殺傷性細胞的ADCC效應，使其周圍的雞紅細胞被溶解，于低倍鏡下可見空斑。計數空斑可算出NK細胞的百分率。第二51Cr釋放試驗：與空斑形成法的主要區別是觀察指標不同。所用的靶細胞除需用相應的抗體處理外，還要用51Cr標記。當靶細胞破損后，標記的51Cr放出胞外，不能再被其他細胞吸收。用γ計數器測量上清中的放射性強度可反映靶細胞破壞程度，從而得知NK細胞的相對水平。

2.LAK細胞活性測定 LAK細胞直接殺傷多種腫瘤細胞的作用依賴于IL-2的存在。若將受檢細胞(效應細胞)與瘤細胞(靶細胞)按一定的效/靶比例混合，再加入一定濃度的IL-2，37℃孵育一定時間后即可影響瘤細胞的代謝，進而殺傷瘤細胞。目前多采用同位素標記法，根據加入同位素先后次序的不同，可分為前標記法(試驗前先用51Cr標記靶細胞)和后標記法(即在效靶反應后摻入3H-TdR)。前者通過測定上清液的放射性強度判斷LAK細胞活性；后者則在培養結束后收集細胞，測其放射性強度，此與LAK活性成反比。

(四)吞噬細胞功能檢測

1.中性粒細胞吞噬功能的測定 較早應用的方法為N試驗，即中性粒細胞在殺菌過程中能量消耗劇增、耗氧量增加、糖代謝增強，致使糖代謝的中間產物6-磷酸葡萄糖增多，并在己糖途徑中氧化脫氫，脫下的氫可被胞漿中的硝基藍四氮唑(nitroblue tetrazolium，N)所接受，使原來淡黃色的N還原成藍黑色的沉淀物，沉積在胞漿內。試驗時取抗凝血與等體積N混合，37℃溫育一定時間后推片，經瑞氏染色后鏡下計數百分率，正常人為10%左右，全身性細菌感染患者可見升高。此外，根據細胞的吞噬作用，將抗凝血與等量5×107/ml的菌液混合，經37℃溫育一定時間后推片、染色，于油鏡下觀察細胞吞噬細菌的情況并計算吞噬率和吞噬指數。

吞噬率＝[吞噬細菌的細胞數/中性粒細胞總數(200個)]×100％

吞噬指數＝(200個粒細菌吞菌總數/200個中性粒細胞)×100％

2.大吞噬細胞的檢測 ①巨噬細胞吞噬功能的檢測：巨噬細胞具有吞噬大顆粒異物的特性，因此常選用雞紅細胞、白色念珠菌、酵母菌等作為吞噬顆粒。將通過斑蟊發泡法獲得的細胞與雞紅細胞懸液于體外37℃溫育一定時間，離心后取細胞涂片染色，鏡檢計算吞噬百分率和吞噬指數即可估計病人巨噬細胞的吞噬功能。②巨噬細胞其他功能的測定：巨噬細胞具有多種胞內和胞外酶，也可分泌一些可溶性因子，這些物質在一定程度上可反映該細胞的功能狀態。胞內酶通過細胞化學染色法檢測，例如最常用的酸性磷酸酶及特異性酯酶的測定。溶菌酶是巨噬細胞的一種胞外酶，其可在體外溶解細菌，若將血清與一定量細菌懸液混勻于比色杯內，經光電比色后記錄每分鐘光密度變化百分率，與標準曲線相比即可得出標本中血清溶菌酶的含量。