免疫熒光非特異性染色的消除方法（一）

一、非特異性染色的主要因素

組織的非特異性染色的機理很復雜，其產生的原因主要可分為以下幾點：

（1）一部分熒光素未與蛋白質結合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。

（2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結合。

（3）除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應抗體結合。

（4）從組織中難于提純抗原性物質，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。

（5）抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現非特異性染色。

（6）熒光素不純，標本固定不當等。

二、消除非特異性染色的方法

消除熒光抗體非特異性染色的方法應根據產生的原因采取適當的方法，常用的方法有以下幾種：

（一）動物臟器粉末吸收法

常用肝粉（豬、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加入肝粉50～100mg,在離心管中充分混勻，在室溫中振動2h，4℃中過夜，再攪拌10min，高速離心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般應在臨用前進行，吸收后之熒光抗體保存冰箱中勿超過2周。染色應作吸收前后之比較，吸收時可先用緩沖鹽水將組織干粉浸濕，離心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入熒光抗體進行吸收，以免消耗過多的抗體。

肝粉或新鮮細胞吸收是一種非特異性的消除方法，對熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸附作用。如檢查組織中的病毒抗原時，也可用相同的組織干粉或勻漿沉淀物吸收之。

用臟器肝粉吸收對熒光抗體損失較多，如果根據Hiramotos氏等的方法將組織的20%生理鹽水勻漿液，用生理鹽水洗2～3次，12000r/min 10min離心沉淀，用其沉淀物吸收其熒光抗體即能完全達到目的，京極方久氏認為這樣吸收對熒光抗體幾乎沒有損失，他們常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用時有必要再吸收一次。

【肝粉的制法】

（1）將若干只小白鼠或大白鼠放血殺死，取出肝臟，用生理鹽水洗2～3次，除去血液，剝掉表面的結締組織的脂肪。

（2）剪碎，用生理鹽水反復洗滌至無血色止，然后再加生理鹽水少許，用組織搗碎機或勻漿器作成勻漿。

（3）將肝勻漿裝入離心管內（1/3左右），交換地用2～3倍量生理鹽水和丙酮反復洗滌各三次，至上清無血色止，每次完畢先用2000r/min離心沉淀15min后，再除去上清液。

（4）最后用丙酮洗滌肝漿，再用布氏漏斗過濾，或離心沉淀，將沉淀物平鋪在潔凈的玻璃板上，37℃烤干（過夜）。

（5）在乳缽中充分研磨，用120目銅篩篩選過后，分裝，密封，低溫干燥保存。