免疫印跡法 （以檢測流行性出血熱病毒結構蛋白和 NP 核蛋白為例說明）
| 實驗方法原理 | 免疫印跡法 是將電泳與免疫酶染色結合起來的一種方法。它先經電泳 (SDS--PAGE)將病毒結構蛋白進行分離，通過轉印將被分離的各區帶原位轉移到硝酸纖維素膜 (nitrocellulose membrane, NC 膜）上， NC 膜當成包被抗原的固相載體，病毒的結構蛋白能與特異性的第一抗體發生反應，借助酶標記第二抗體及底物，在相應部位顯現出來，以證明病毒結構蛋白的存在。所以操作分為電泳、轉印和酶免疫測定三個階段。 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | 丙烯酰胺單體、雙體過硫酸銨TEMED蛋白Marker10% 甘油考馬斯亮藍流行性出血熱病毒抗血清或恢復期病人血清或特異性單克隆抗體抗兔或抗人IgG 辣根過氧化物酶結合物3 3'-二氨基聯苯胺及 H202 原液 |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 1) 樣品制備：病毒感染 Vero E6 細胞后的上清培養液，經 4℃ 5000 r/min 離心 30 min, 離心后的上清移至超速離心管（每管 35 ml 左右），加 300 g/L 蔗糖-TNE 墊層， 25000 r/min 離心 2 h, 棄上清，用少量 TNE 懸起沉淀即為初步純化病毒。 2) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE): 采用不連續系統，將 25μl 樣品加等量樣品緩沖液混合，煮沸 2 min 待冷卻后上樣。電泳條件為穩流 10-20 mA,9-12 h 或 50V恒壓電泳過夜 (14-16 h) 。電泳結束后取下凝膠。 部分凝膠進行常規考馬斯亮藍染色：浸入1g/L 考馬斯亮藍溶液（水：甲醇：冰醋酸 =5:5 : 1) 中1 h,取出凝膠用脫色液 (5%甲醇，10% 冰醋酸水溶液）脫色，換液數次后，用無考馬斯亮藍的 5% 甲醇、10% 冰醋酸水溶液在脫色搖床上繼續脫色至透明，照相記錄。 3) 蛋白條帶的電轉移：上述剩余的大部分凝膠置于 NC 膜上，電轉移時在雙層夾板中的層次順序為：正極夾板海綿濾紙NC 膜凝膠濾紙海綿夾板負極。電流方向從負極至正極，條件為電流 0.5-0.7 A, 電壓 100~120V, 時間 4~6 h 。 4) 免疫酶染色：轉移完畢后，將 NC 膜浸入封閉緩沖液，在脫色搖床上搖動 2~6 h, 于封閉液中直接加人特異性抗血清或恢復期病人血清（或特異性單克隆抗體），置 37℃ 2 h, 用 2g/L Tween 20 PBS 洗滌液洗 4 次，加相應的辣根過氧化物酶標記抗體 (IgG),置 37℃l h, 同樣洗滌 4次，加酶染底物溶液顯色數分鐘，用自來水沖洗，終止反應。 (5) 結果：經初步純化的病毒標本，經上述電泳，考馬斯亮藍直接染色后或經轉移，抗體及酶染色反應后，在相應部位可見三個明顯流行性出血熱病毒結構蛋白條帶，從上到下分別代表病毒結構蛋白 G1 (72~68 kD) 、 G2( 55~52 kD) 糖蛋白和 NP 核蛋白 (50~48 kD), 以 NP 顯色最為明顯。 |
| 注意事項 | |
| 其他 | 免疫印跡法結合了電泳的高分辨率和酶免疫測定的高敏感性和特異性，方法簡便、標本可長期保存、結果便于比較。 其他試劑： l)TNE緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl,pH7.4-7.6 0.15 mol/L NaCl,5 mmol/L EDTA。 2)分離膠：2 mol/L pH8.9 Tris-HCl 10 ml,(單）丙烯酰胺/（雙）丙烯酰胺(50:0.8/100 ml)12.5 ml,100 g/L SDS 0.5 ml,10 mol/L尿素12.5 ml,TEMED 50μl,過硫酸銨(30mg/ml)1.1ml,雙蒸水13.4ml,總量約50ml。 3)濃縮膠：0.5 mol/L pH6.7 Tris-HCl1ml,(單）丙烯酰胺/（雙）丙烯酰胺(50:1.5/100ml)1 ml,100 g/L SDS 0.1ml,10mol/L尿素5ml,TEMED 10μ1,過硫酸按(30 mg/ml)0.3 ml,雙蒸水2.7 ml,總量約10 ml。 4)電泳緩沖液：Tris 12g,甘氨酸57.6 g,100 g/L SDS 20 ml,加蒸餾水到2,000 ml。 5)樣品緩沖液：0.05mol/L Tris-HCl(pH6.7),20 g/L SDS,5% 2-琉基乙醇，10%甘油，0.2g/L溴酚藍。 6)轉移緩沖液：Tris 7.88g,甘氨酸28.8g,甲醇400 ml,加蒸餾水到2000 ml。 7)封閉緩沖液：0.02 mol/L pH7.4 PBS,2g/L Tween20,20 g/L牛血清蛋白。 8)酶染稀釋緩沖液：0.02 mol/L pH7.4 PBS,0.5-1.0g/L Tween20,10%牛血清。 9)洗滌液：0.02 mol/L pH7.4 PBS,2g/L Tween20。 10)酶染底物溶液：3,3'-二氨基聯苯胺（鹽酸鹽）(DAB)5 mg,0.0 2mol/L pH7.4 PBS 10 ml,H2O2原液50μl |