體積排除色譜的分離，是在裝填有多孔性材料的色譜柱中進行的。多孔材料的孔有大有小。孔徑，有其“孔徑分布”。當流動相攜帶分子量不同的溶質進入色譜柱后，溶質會因濃度差而滲入或擴散進入填料的孔中。也就是說，溶質在兩相中的運動的動力是濃度梯度。但是，分子體積的大小，造成了在孔中擴散路徑的差異。形象地說，填料顆粒上的孔有大有小，但對于溶劑分子來說，它們是足夠大的，可以允許它們自由地擴散、進出。不過，對于體積大的分子來說，它們只能進入尺寸大于該分子的孔，對于比顆粒上的孔還要大的分子，它只能從孔旁流過。換句話說，分子量或分子尺寸較小的溶質，能占有更多的孔體積。這樣，分子體積不同的混合物一齊進入柱端時，經過淋洗、擴散，總是體積大的分子先流出柱子，分子量小的(即體積小)分子滯后流出。