肝素酶具有許多重要的醫藥用途，主要用途如下：
（1）制備低分子和超低分子肝素
低分子量肝素和超低分子量肝素具有抗凝血功能，在抑制血管增生，阻止腫瘤轉移，治療癌癥，抗過敏等方面也有特殊的功效。利用肝素酶生產低分子肝素條件比較溫和，環境友好而且不會作用于硫酸基團，是理想的工業生產方法。
（2）體外循環血液中肝素的消除
某些重癥病人例如尿毒癥患者在手術過程中需要進行血液的體外循環，在體外循環的過程中為防止血液凝固需要加入肝素。為防止肝素殘存在血液中影響血液凝固，臨床上需要加入魚精蛋白來中和肝素。臨床研究發現魚精蛋白嚴重損害血小板，影響動脈血壓得穩定，而肝素酶沒有這種副作用，因此是理想的替代材料。需要注意的是，由于肝素酶對細胞外基質也有降解作用，因此用于血液肝素化去除的肝素酶也需進行固定化，并且要求肝素酶不能有免疫原性。
（3）肝素精確結構的確定
將待分析的肝素先用來自肝素黃桿菌的經過純化所得到的肝素酶進行降解，得到四糖產物，然后再用同樣來自肝素黃桿菌的經過純化所得到的乙酰肝素酶進行深層降解處理，通過對最終的產物分析，就可以推測出相應的肝素的結構。
（4）制備抗腫瘤藥物
由于肝素酶與腫瘤轉移密切相關，因而越來越受到重視。許多研究人員試圖尋找肝素酶的抑制劑，如硫酸海帶多糖等，抑制腫瘤的生長和轉移。
（5）抑制新血管生成及堿性成纖維細胞生長因子介導血管內皮細胞的增殖
新血管的形成關系到組織的分化，傷口的愈合和腫瘤的轉移。大多數的研究者都把精力放在肝素類物質在新血管的形成過程中所起的作用。其實眾多的體外還是體內的新血管生成及堿性成纖維細胞生長因子介導血管內皮細胞的增殖實驗表明，肝素酶I和III（不包括肝素酶II）可以有效地抑制它們的發生。其作用的機理可能是在過程中起重要作用的乙酰肝素的某一部分被肝素酶切除，使新血管的形成得到抑制。
（6）肝素酶在產科領域中的應用
胚泡植入需要子宮內膜細胞表面成分發生相應的變化。肝素酶能調節胚泡滋養層細胞，使其更易粘附和植入子宮內膜。同時，肝素的側鏈可結合多種活性因子:如表皮生長因子，血管內皮細胞生長因子，肝素結合的表皮生長樣因子及其他生長因子與細胞因子。肝素酶分解肝素側鏈后，這些因子釋放，可以促進滋養細胞分裂、增殖和血管生成。
胎盤組織是一種細胞滋養細胞侵入子宮內膜后形成的特殊結構，滋養細胞有很強的侵入能力。肝素酶通過分解肝素側鏈，釋放出細胞因子，促進滋養細胞侵入血管基底膜，使新生血管形成，為胚胎組織生長發育奠定基礎。肝素酶與妊娠的成功和分娩的發動也有一定的關系。