關于酶切的一點經驗（zz）

酶切反應系統包括：DNA，酶，buffer，滅菌水。

不同公司的酶和buffer系統是不同的，所以一個反應應該用同一個公司的酶和buffer(常識)。NEB和promega的酶都不錯的，我們常用的酶是NEB(new england biolabs)公司生產的酶。使用前應該閱讀NEB公司的產品目錄和該酶的使用說明。下面分幾個方面簡要說明：

1，DNA，自己制備的DNA，樣品中不應該有酚，氯仿，酒精，EDTA，鹽離子等的污染，這些東西會影響酶的活性。這個問題應該在提質粒階段避免。

2，酶，酶量并不是越大越好，酶體積不應該超過總反應體積的1/10。(因為酶是儲存在50%甘油中的，而反應體積中甘油的濃度超過5%就會使酶出現星號活性，即切割不應該切的位置)。如果切點位于線狀質粒兩端，酶切效率將會大大降低。

3，buffer，不同的酶配有不同的buffer，產品目錄和酶的使用說明中會說明該酶用哪種buffer，有些buffer中需要另外添加BSA，不要忽略了哦。

4，反應體積，通常1到幾微克DNA的反應體積可以控制在50到100微升，用20單位的酶來切。

5，反應條件，大多數酶都是37度半小時以上。

6，電泳檢測。條帶不清楚跟電泳也有關系。首先是膠的濃度，不同濃度的膠適合分離不同大小的片段，這個你看看分子克隆之類的書，一般來說，1%的gel可以用于500bp-6，7kb的片段分離。其次是電壓，電壓不能太高。這些你肯定都很清楚，我就不贅述了。還有如果載體很大，而切下來的片段很小，那么切下來的片段就會因為質量小而不容易看清楚，比如從10kb的載體上切下來200bp的片段這種情況，解決方法就是多切一些，再點marker仔細看。

7，雙酶切。因為不同的酶需要不同的buffer，所以有兩種情況：1)兩種酶是同樣的buffer。盡量用同一個公司的酶，這樣就跟單酶切操作差不多，可以同時加入兩種酶，注意事項是體積和酶量。2)兩種酶是不同的buffer，先用一種buffer離子濃度底的酶切，電泳檢測，單酶切開以后，將產物抽提，沉淀，加入離子濃度高的buffer再酶切。http://www.neb-china.com/cn/tech/re/double_digests.htm網站也有建議。

這個網站也可仔細看看啊，總之熟能生巧，實驗肯定是越做越好的。

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