內毒素測定實驗

實驗方法原理

鱟是一種海洋節肢動物，其血液中的有核變形細胞含有凝固酶原和可凝固蛋白。將這些變形細胞凍融裂解后制成鱟變形細胞溶解物（limulus amebocyte lysate，LAL），此溶解物若與待檢標本中的內毒素相遇，內毒素激活 LAL 的凝固酶原成為凝固酶，作用于可凝固蛋白，使其凝聚成凝膠狀態，鱟試驗是目前檢測內毒素最敏感的方法之一，比家兔熱原試驗敏感 10～100 倍,可測出 0.01～1 ng／ml 的微量內毒素。

鱟試驗在臨床上用于革蘭氏陰性菌感染引起的內毒素血癥、革蘭氏陰性細菌性腦膜炎的早期診斷，以及用于藥劑、生物制品中的熱原檢査，是一種快速、簡便和離度靈敏的方法。

鱟試驗主要有三種方法：凝膠法、沉淀蛋白法和產色底物法。后二種方法是從凝膠法改進而來，其靈敏度比凝膠法高 5～10 倍以上，可定量測定內毒素的含量，但操作較繁瑣。

下面介紹常用的方法——凝膠法。

實驗材料 待檢樣品

試劑、試劑盒 鱟試劑標準內毒素無熱原的無菌蒸餾水

儀器、耗材 小試管吸管恒溫水浴箱

實驗步驟

1. 取鱟試劑一支，按說明加入規定量的無熱原的無菌蒸餾水使之溶解。

2. 取內毒素標準品，用無熱原的無菌蒸餾水溶解。

所用濃度按毎批溶解構的敏感性而定。

一般稀釋至 20 Eu／ml（Eu 為內毒素單位）。

3. 取 3 支小試管，分別編號，按下表加人各成分并進行操作。

4. 孵育結束，將試管從水浴中輕輕取出。

不要振動試管，以防凝膠破壞，產生假陰性。

緩緩倒轉試管 180°，如凝成固體凝塊，為陽性；呈半流動狀為弱陽性；僅見混濁度增加，或有少量絮狀鈞，或無變化，則為陰性。

注意事項

因極微量的內毒素即可導致 LAL 凝膠化，本試驗所用試管、吸管等均須預先進行去熱原處理。玻璃等耐熱物品可干熱 180 ℃ 以上 2 h 或 250 ℃ 30min，以徹底破壞內毒素；不耐熱物品可用雙氧水浸泡。

其他

鱟試驗測定內毒素雖敏感，但試驗中，下列因素可影響其敏感性：

1. LAL 試劑的質量，每批試劑的敏感性可有不同，而這種差異與來源、制備方法等有關。

2. pH 對 LAL 凝膠化有明顯影響，應將 pH 控制在 6～8 內，最適 pH 為 7.0 土 0.2，因此，在檢測藥物熱原時，對偏酸或犏減藥物，須先調正其 pH。

3. 孵育溫度和時間。一般為 37 ℃，45～60 min，也可孵育 4～24 h，延長觀察時間，可增加陽性率。

4. 待檢物的性質，如檢測血液中內毒素濃度低于 10 ug／L 時，僅能在血小板部分測出。

用本法測定時。宜用含血小板豐富的血漿。

如用蒸鎦水稀釋。不僅血小板溶解放出內毒素，且能稀釋血漿中的抑制因子，故可明顯增強內毒素活性。為了去除血液中的抑制因子，可將稀釋血漿加熱后進行試獫，或用氯仿抽取等方法。