劉震：管內硼親和固相微萃取HPLC助力發現最佳沏茶溫度

　　近日，《色譜》期刊編委劉震團隊發布新成果——管內硼親和固相微萃取-高效液相色譜全自動在線聯用檢測茶飲料中的順式二羥基化合物。

　　王欣, 何堅剛, 羅琪, 劉震*

　　色譜, 2020, Vol. 38 Issue (1): 137-142

　　DOI: 10.3724/SP.J.1123.2019.06020

管內硼親和固相微萃取-高效液相色譜全自動在線聯用檢測茶飲料中的順式二羥基化合物

　　固相微萃取(SPME)是20世紀90年代興起的一項新穎的樣品前處理與富集技術。SPME技術自創立以來得到迅速發展與廣泛應用。SPME將樣品取樣、樣品制備和樣品濃縮等過程集成到一個萃取相并一步完成, 能與分析儀器進行離線或在線聯用。絕大多數的SPME是利用非共價相互作用(如疏水相互作用等)將目標分子吸附到萃取相表面, 因而存在著作用力弱和選擇性較差的缺點。因此, 和常規的SPME相比, 以取代硼酸為配基的硼親和SPME具有多種優點:(1)選擇性較高, 能選擇性萃取核苷酸、糖蛋白和糖肽等重要的順式二羥基生物分子； (2)作用力較強, 解離平衡常數(Kd)通常為10-1~10-4mol/L, 相對于非共價作用, 萃取能力較強； (3)由于非共價作用導致的非特異性吸附可以通過重復清洗萃取相的辦法清除； (4)可以通過使用酸性pH或加入單糖等頂替試劑即可實現目標物的解吸, 不需要高溫、高鹽濃度、高有機溶劑等容易導致生物分子變性的苛刻條件。

　　SPME的一個重要優勢是其易于與分析儀器進行聯用。但是, 與SPME-GC聯用相比, SPME-HPLC聯用的實際應用相對要少得多。這主要是因為SPME-HPLC聯用受以下兩個因素的限制:分析物在液相和常溫條件的解吸時間長, 容易造成樣品殘留和樣品區帶展寬； 自動化的SPME-HPLC聯用接口和聯用方法很少。硼親和固相微萃取的萃取/解吸為受pH調控的可逆過程, 溶質的解吸非常容易, 采用弱酸性溶液洗脫即可。該特征使得硼親和固相微萃取特別適用于HPLC進行在線聯用。

　　兒茶素和茶黃素是茶葉中重要的活性成分, 它們均為順式二羥基化合物。兒茶素能有效地抑制或延緩中風、衰老、癌癥和糖尿病的發生, 而茶黃素具有調節血脂、預防心血管疾病的功效, 而且無毒副作用, 被譽為茶葉中“軟黃金”。因此, 對茶葉及茶飲料中的兒茶素等順式二羥基化合物的自動分析與檢測對于茶葉及其制品的質量控制具有重要意義。

　　本文報道了一種新穎的管內硼親和固相微萃取-高效液相色譜全自動在線聯用, 用于分析茶飲料中的順式二羥基化合物。該自動化在線聯用方法利用商品化HPLC儀器配備的自動進樣器通過六通閥的切換實現流路連接。在本文中, 制備了管內硼親和SPME毛細管, 考察了涂層柱的柱容量并對其形貌進行了表征, 考察并優化了影響實際樣品分離效果的因素, 最后, 利用該聯用方法對3種不同品牌的茶飲料進行了分析, 并對沏茶溫度對茶水中順式二羥基化合物含量的影響進行了評價。

　　1、實驗原理示意圖

　　管內硼親和固相微萃取-高效液相色譜全自動在線聯用的原理見圖 1。該在線聯用分為兩步:萃取, 解吸和分離。在萃取時, 萃取毛細管與自動進樣系統的計量泵相連, 樣品反復多次從樣品瓶中被吸取到硼親和萃取毛細管并排出； 在解吸和分離時, 通過切換六通閥, 硼親和萃取毛細管連接到液相色譜, 被萃取到萃取毛細管管壁上的順式二羥基化合物用酸性流動相洗脫, 然后直接注入HPLC系統進行分離和檢測。

　　2、硼親和涂層柱制備

　　硼親和涂層柱按照文獻方法適當修改后制作。首先進行毛細管管壁預處理:石英毛細管依次用1 mol/L NaOH溶液沖洗30 min, 水沖洗至中性, 1 mol/L HCl溶液沖洗30 min, 水沖洗二次至中性, 再用氮氣吹掃12 h至干。將γ-MAPS/MeOH(1:1, v/v)溶液注入毛細管, 在45 ℃水浴中反應過夜。反應結束后用甲醇沖洗毛細管, 氮氣吹干, 得到內壁衍生了雙鍵的毛細管空管。然后進行涂層柱的制備:1 mg AIBN溶于40 μL EDMA溶液中, 加入20 mg VPBA, 再加入195 μL一縮二乙二醇和45 μL乙二醇, 渦旋, 在冰浴中超聲15 min。將配好的溶液注入內壁衍生了雙鍵的毛細管中, 在75 ℃水浴中反應2 h, 用HPLC泵將未反應完全的溶液泵出后在毛細管內壁留下涂層, 將制得的涂層柱用甲醇沖洗除去殘留的未反應物。

　　3、色譜分離條件

　　色譜柱:Venusil XBP-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)； 柱溫:20 ℃； 流動相:甲醇/10 mmol/L甲酸(50:50, v/v)； 流速:0.5 mL/min； DAD檢測波長:275 nm。

　　4、樣品制備

　　取適量茶飲料, 加入等體積100 mmol/L磷酸二氫鈉后用氫氧化鈉溶液調節pH到8.5, 加入偏亞硫酸鈉(6 mmol/L)防止兒茶素氧化, 混勻后取適量進樣。

　　分別稱取1 g溧陽綠茶于3個茶杯中, 依次用150 mL溫度為95、85、75和65 ℃的水加入杯中, 加蓋泡30 min, 之后分別取上清液與同體積的50 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液混合, 之后加入偏亞硫酸鈉, 用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調節pH到8.5。將1.5 mL經過處理的樣品放入樣品瓶中進行全自動SPME-HPLC測定。

　　結論

　　以硼親和高分子涂層毛細管柱作為管內固相微萃取柱, 以商品化和自制茶飲料中的順式二羥基化合物為目標分析物, 通過對自動進樣系統的流路進行簡單改動, 成功建立了硼親和SPME與HPLC的自動化在線聯用。該在線聯用方法能明顯提高對實際樣品中的順式二羥基化合物的檢測靈敏度。由于整個萃取和分離過程由計算機自動控制, 該聯用系統能提供良好的萃取和分離重現性。利用該系統所得的色譜圖能在一定程度上體現不同茶飲料中的順式二羥基組分的濃度差異。此外, 對沏茶溫度的考察顯示, 為獲得最大量的兒茶素等順式二羥基化合物成分, 存在一個最佳的沏茶溫度。

（轉載：色譜期刊）

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