利用間接放射免疫法檢測樣品的mTNF

實驗概要

本實驗利用間接放射免疫法檢測樣品的mTNF。選用兩種抗體，一抗為抗TNF抗體，可與細胞膜表面的mTNF特異性結合；二抗為抗一抗抗體，且標記放射性同位數¹²⁵I，可與一抗特異性結合，通過測定其放射活性，并與標準品對照，即可間接測定細胞膜表面的TNF。

實驗原理

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)是一類能直接導致某些腫瘤細胞壞死的細胞因子，有TNF-α與TNF-β兩種類型。TNF-α主要來源于活化的單核/巨噬細胞，TNF-β主要來源于活化的T淋巴細胞。雖然兩型TNF的細胞來源不同，結構也不同，但均能與不同的受體結合，故具有極其相似的生物學活性。TNF可進入體液成為分泌型(或可溶性)TNF(sTNF)，也可與細胞膜結合成為跨膜型(或膜結合型)TNF(mTNF)。應用標記的抗TNF特異性抗體，利用抗原抗體反應檢測TNF即為TNF的免疫學檢測法。可檢測待測樣品中sTNF的精確定量，也可檢測mTNF，還可區分TNF-α與TNF-β兩種類型。主要方法有ELISA法、RIA法、FIA、FCM或FACS法等。

主要試劑

1. 1%多聚甲醛

2. 含3%牛血清白蛋白的PBS(3%BSA-PBS)及PBS

3. 一抗：兔抗TNF的抗血清

4. 二抗：¹²⁵I標記的驢抗兔IgG

5. 未免疫兔血清

6. 制備好的巨噬細胞懸液(細胞濃度為1×10⁶ml)

主要設備

1. 96孔PVC板(聚本乙稀板)

2. γ-計數儀，溫浴箱，刻度吸管，毛細吸管，加樣器(頭)

實驗步驟

1. 將準備好的巨噬細胞懸液加入PVC板各孔中，0.1ml/孔，再用1%多聚甲醛固定于PVC板中，然后用PBS洗去多余的多聚甲醛；

2. 設立不同倍比稀釋度的TNF標準品；

3. 加入3%BSA-PBS，每孔0.1ml， 37℃孵育1h，以封閉抗體非特異性結合位點；

4. 棄上清，每孔加入1：50稀釋度的兔抗TNF血清(一抗)。以未免疫兔血清作為陰性對照，37℃孵育45min；

5. 用PBS洗3次，以去除未結合的一抗；

6. 加入¹²⁵I標記的驢抗兔IgG(二抗，2000cpm/孔)，37℃孵育45min；

7. 用PBS充分洗板后，用γ-計數儀測量放射活性；

8. 從標準曲線中即可求得待測細胞mTNF含量。