| 實驗材料 | |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | MgCl2核苷三磷酸溶液轉錄緩沖液去離子超濾水T7 RNA 聚合酶固體 EDTA尿素緩沖液NaCl乙醇EDTAATPT4 多核苷酸激酶緩沖液T4 多核苷酸激酶T4 DNA 連接酶緩沖液T4 DNA 連接酶乙酸鉀溶液兔網織紅細胞裂解物翻譯試劑盒氯化鉀乙酸鎂不含核酸酶的水兔網織紅細胞裂解物35S甲硫氨酸對照 RNA |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」 1. 如下在冰上配制 1 ml 轉錄反應混合物，最后加入 T7 RNA 聚合酶： DNA庫（終濃度為 5～50 nmol/L） 35 ul 1 mol/L MgCl2 50 ul 各成分為 100 mmol/L 核苷三磷酸混合物（各 NTP 終濃度為 5 mmol/L） 100 ul 10× 轉錄緩沖液（最終為 1×） 加入去離子超濾水補至 980 ul 20 ul 10 U/ul T7 RNA 聚合酶（最終為 200 U/ml） 轉錄反應于 37℃ 孵育 3～16 h。用冰上冷卻或加入固體EDTA至終濃度 50 mmol/L 以終止反應。 2. 用變性 PAGE 純化所得的 RNA。往轉錄反應中加入固體尿素至 5 mol/ L、加入 EDTA 至 50 mmol/L， 于 90°C 加熱 2 min， 上樣到變性 PAGE 膠上。 3. 電泳結束后，紫外照射顯影并割下純化的 RNA 條帶。通過被動洗脫將 RNA 提取到 300 mmol/L NaCl 溶液中或用電洗脫儀并按廠家的說明將RNA洗脫到 0.5×TBE 中。 4. 加入3 mol/L NaCl （終濃度 300 mmol/L）和 2.5 倍體積的乙醇沉淀 RNA。 于 -80℃ 冷凍 20 min 或于 -20℃ 冷凍過夜。 5. 于 4℃，12 000 g 離心 10 min 棄上清，用 70％ 乙醇洗滌沉淀，抽干，溶于 0.5 ml 去離子超濾水中，用紫外-可見分光光度計測量 260 nm 的吸收值以測定濃度。 6. 合成接頭，即 3' 端為嘌呤霉素的 DNA 寡核苷酸，長度約為 30 核苷酸，「無結構」 例 a.AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCP 例 b.AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA999ACCP 在例 b 中，「9」 是指 phosphoramidite spacer 9 （Glen Research），「P」指嘌呤霉素， 來源于CPG-嘌呤霉素（Glen Research）。該接頭能得到高顯示的蛋白質產量。 以嘌呤霉素為末端的DNA寡核苷酸是用變性 PAGE 膠純化，從膠里回收，然后如前所述沉淀下來。將 DNA 接頭溶解于去離子水中并用紫外-可見分光光度計測量 260 nm 的吸收值以測定濃度。 7. 用多核苷酸激酶憐酸化 DNA 接頭的 5' 端，1 ml激酶反應體系如下： 300 ul 100 um DNA 接頭（終濃度 30 um） 10 ul 100 mmol/L ATP （終濃度 1 mmol/L） 100 ul 10×T4 多核苷酸激酶緩沖液（終濃度 1×） 490 ul 水 100 ul 10 U/ul T4 多核苷酸激酶（最終為 200 U/ml） 8. 反應混合物在 37°C 孵育 2 h，加入200 ul 100 mmol/L EDTA，90℃ 加熱 5 min，然后用凝膠過濾柱脫鹽。 9.合成 splint。splint是一種 DNA 寡核苷酸，其序列為（從 5' 端起）與 RNA 庫的 3' 端互補的≥10 核苷酸加上與接頭 5' 端互補的≥10 核苷酸， 通常為 T10。用變性 PAGE 純化。 10. 如步驟 3 從凝膠提取、如步驟 4 沉淀 DNA。 11. 用去離子水溶解純化的 splint 并用紫外-可見分光光度計測量 260 nm 的吸收值以測定濃度（見步驟 5）。 12. 在 splint 存在下用 T4 DNA 連接酶連接接頭和 RNA 模板以產生 mRNA 顯示模板。 配制下列 1 ml 連接反應體系： 100 ul 100 umol/L 5' 磷酸化的 DNA 接頭（最終為10 um） 100 ul 100 umol/L RNA 庫（最終為 10 um） 100 ul 100 umol/L splint （最終為 10 um） 580 ul 水 13. 混合物加熱到 95℃ 放置 2 min，然后加入 100 10×T4 DNA連接酶緩沖液（最終為 1×） 14. 將所得混合物渦旋振蕩，置于冰上冷卻 10 min， 然后使其升至室溫后加入 20 ul 2000 U/ul T4 DNA 連接酶（最終為 40 U/ml）。 15.反應體系在室溫下孵育 20 min。加入 150 ul 100 mmol/L EDTA 和 500 mg 固體尿素，90℃ 加熱 5 min。 16. 用變性 PAGE 膠純化連接好的 mRNA 顯示模板，膠回收（見步驟 3）， 然后如步驟 4 沉淀，但是改用 3 mol/L 乙酸鉀（pH 5.3）代替 3 mol/L 氯化鈉。 17. 用去離子水溶解純化的 mRNA 顯示模板并用紫外-可見分光光度計測量 260 nm 的吸收值以測定濃度。 在 mRNA 顯示模板用于大規模翻譯之前，應當嘗試一并進行各種對照組的小規模翻譯以有助于在蛋白膠上鑒別 mRNA 展示蛋白所對應的條帶。 18. 在冰上配制翻譯反應體系，最后加入兔網織紅細胞裂解物。 19. 于 30℃ 孵育 1 h，然后往各反應體系中加入 1.7 ul 1 mol/L MgCl2 和 7.8 ul 2.5 mol/ L KCl， 于室溫下放置 5 min。 20. 用 Tris-tricine SDS-PAGE 分析各個翻譯反應的產物。 21. 一旦顯示的蛋白質已用 SDS-PAGE 觀察到，優化反應體系的乙酸鎂和氯化鉀的濃度。逐漸從 0.5～2 mmol/L 增加乙酸鎂的濃度以及氯化鉀的濃度從 50～200 mmol/L 平行進行一系列的翻譯反應。 22. 如下在冰上制備 1 ml 反應體系，最后加入網織紅細胞裂解物： 80 ul 5 umol/L mRNA 顯模板（最終為 400 nmol/L） 80 ul 12.5×不含甲硫氨酸的翻譯混合物（最終為 1×） 20 ul 8.6 umol/L ［35S］ 甲硫氨酸（最終為 0.17 umol/L） 2.5 mol/L KCl （按照優化濃度） 0.5 ul 乙酸鎂（按照優化濃度） 補水至 600 ul 400 ul 2.5×兔網織紅細胞裂解物（最終為1X） 總體積 1000 ul 23. 于 30℃ 孵育 1 h， 然后往上述各反應體系中加入 65 ul 1 mol/L MgCl2 和 235 ul 2.5 mol/L KCl，于室溫下放置 5 min。 |
| 注意事項 | |
| 其他 | 1. 材料 DNA庫 2. 試劑 1 mol/L MgCl2 100 mmol/L 核苷三磷酸溶液 10× 轉錄緩沖液 去離子超濾水 10 U/ul T7 RNA 聚合酶 固體 EDTA 尿素 0.5×TBE 緩沖液 3 mol/L NaCl 100％ 和70％ 乙醇 100 mmol/L EDTA 末端為嘌呤霉素的DNA 接頭 100 mmol/L ATP T4 多核苷酸激酶緩沖液 T4 多核苷酸激酶 10×T4 DNA 連接酶緩沖液 10 U/ul T4 DNA 連接酶 3 mol/L 乙酸鉀溶液，pH 5.3 兔網織紅細胞裂解物翻譯試劑盒（如 Red Nova Lysate kit， Novagen） 對照 RNA 12.5× 不含甲硫氨酸的翻譯混合物 2.5 mol/L 氯化鉀 25 mmol/L 乙酸鎂 不含核酸酶的水 兔網織紅細胞裂解物 35S 甲硫氨酸 3. 耗材 電洗脫儀（VWR 或 Schle1cher SchuelD） 變性 PAGE 膠凝膠過濾柱（Pharmacia） |
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