動物肝臟RNA的制備(苯酚法)和純度測定1

原理
細胞內大部分RNA 均與蛋白質結合在一起，以核蛋白的形式存在。因此分離RNA時必須使RNA與蛋白質解離，并除去蛋白質。除去蛋白質的方法主要有：（1）用氯仿－辛醇混合液劇烈振蕩，使蛋白質變性。（2）在冷的2mol/L鹽酸胍溶液中沉淀RNA，大部分蛋白質仍處于溶解狀態。（3）以去污劑如十二烷基硫酸鈉（SDS）處理，使核蛋白解離，蛋白質變性。（4）以含水的酚溶液除去蛋白質。去污劑和酚均能抑制RNA酶活力，有利于制備核酸大分子。目前應用最廣的是苯酚法。
以酚水兩相系統分離RNA是將細胞或細胞器置于含有SDS的緩沖鹽溶液中，加等體積水飽和的酚，通過劇烈振蕩，然后離心形成上層水相和下層酚相。核酸溶于水相，被酚變性的蛋白質或溶于酚相、或在兩相界面處形成凝膠層。實驗所用的0.15mol/L緩沖鹽溶液系統可使大部分核糖核蛋白解離，在用酚處理時脫氧核糖核蛋白變性；在低溫條件下，從水相中除去，這樣得到的RNA制品中混雜的DNA量極低。RNA制品繼續用氯仿－異戊醇處理，可以進一步除去其中含有的少量蛋白質。最后用乙醇使RNA自水溶液中沉淀下來。

實驗所得制品的核酸含量可用紫外吸收法和定磷法測定，然后用地衣酚顯色法測定RNA含量，二苯胺顯色法測定DNA含量，Folin－酚試劑法測定蛋白質含量。

操作方法
取2g動物肝臟組織，剪成小塊，在乳缽種研碎，加20mLSDS-緩沖鹽溶液（見試劑1.）使成均漿，倒入磨口具塞錐形瓶內，再加同樣體積的含水酚液，室溫下劇烈振蕩10分鐘。置冰浴中分層，在0-4℃下，以4000rpmn離心15分鐘。吸出上清液，加等體積氯仿－異戊醇，室溫下劇烈振蕩10分鐘，以4000rpm離心5分鐘，或在室溫下放置10分鐘使分層。吸出上清液（若有必要，該操作可反復多次），加2倍體積2%乙酸鉀的乙醇溶液，在冰浴中放置1小時使RNA沉淀，此沉淀液可在冰箱內較長期存放。若要得到干燥制品，可將沉淀液以4000rpm離心10分鐘，傾去上清液。沉淀用少許75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇各洗1次，同上法離心，傾去乙醇后，空氣干燥。
將RNA（準確稱取30mg左右RNA干燥制品）溶于5～10mL蒸餾水中，離心除去不溶性雜質，測定上清液中蛋白質含量（Folin－酚試劑法見本學期實驗二），核酸含量（見本實驗[附1]、[附2]、[附3]、[附4]）。
試劑和器材
試劑
1.SDS-緩沖鹽溶液［0.3%SDS-0.1mol/L氯化鈉-0.05mol/L，pH5.0乙酸鹽緩沖液］稱取1.5gSDS，2.92g氯化鈉，2.05g乙酸鈉溶于水中，用乙酸調至pH5.0，最后定容至500ml。
2.含水酚液：使用前將苯酚重蒸(酚的沸點為181.8℃)并用SDS－緩沖鹽溶液使其飽和。
3.氯仿-異戊醇液：氯仿：異戊醇=24:1(V/V)。
4.含2%乙酸鉀的95%乙醇溶液。
5.75%乙醇，95%乙醇、無水乙醇。
6.乙醚
7.測定用試劑見本實驗［附1］、［附2］、［附3］、［附4］。

器材
1.剪刀、鑷子 2.乳缽 3.磨口具塞錐形瓶(500ml)
4.天平 5.離心機(4000rpm) 6.動物肝臟
［附1］紫外吸收法測定核酸含量
原理
DNA和RNA都有吸收紫外光的性質，它們的吸收高峰在260nm波長處。吸收紫外光的性質是嘌呤環和嘧啶環的共軛雙鍵系統所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它們的物質，不論是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性，核酸和核苷酸的摩爾消光系數(或稱吸收系數)用κ(P)260nm來表示，κ(P)260nm為每L溶液中含有1摩爾核酸磷的光吸收值。RNA的κ(P)260nm (pH7為7700~7800)。RNA的含磷量約為9.5%，因此每mL溶液含1μg RNA的光吸收值相當于0.022~0.024。小牛胸腺DNA鈉鹽的κ(P)260nm(pH7)為6600，含磷量為9.2%，因此每mL溶液含1μg DNA的鈉鹽光吸收值為0.020。
蛋白質由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白質的吸收高峰在280nm波長處，在260nm處的吸收值公為核酸的十分之一或更低，故核酸樣品中蛋白質含量較低時對核酸的紫外測定影響不大。RNA的260nm與280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm與280nm吸收的比值則在1.9左右。當樣品中蛋白質含量較高時比值即下降。

操作方法

將樣品配制成每mL含5~50μg核酸的溶液，于紫外分光光度計上測定260nm和280nm吸收值，計算核酸濃度和兩者吸收比值。

A260nm式中： 為260nm波長處光吸收讀數；L為比色池的厚度一般為1或0.5cm;0.024為每mL溶液內含1μg RNA的光吸收；0.020為每mL溶液內含1μgDNA鈉鹽時的光吸收值。

 [附2]二苯胺顯色法測定DNA含量

原理
脫氧核糖核酸中的2-脫氧核糖在酸性環境中與二苯胺試劑一起加熱產生藍色反應，在595nm處有最大光吸收。 DNA在40-400μg范圍內，光吸收與DNA的濃度成正比。在反應液中加入少量乙醛，可以提高反應靈敏度。除DNA外，脫氧木糖、阿拉伯糖也有同樣反應。其他多數糖類，包括核糖在內，一般無此反應。
操作方法
一、DNA標準曲線的制定
取10支試管，分成2組，依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mLDNA標準溶液。添加蒸餾水，使之都成2mL。另取2支試管，各加2mL蒸餾水作為對照。然后各加入4mL二苯胺試劑，搖勻。于60℃恒溫水浴中保溫1小時，冷卻后于595nm處進行比色測定。取兩管平均值，以DNA濃度為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線。
二、制品的測定
取2支試管，各加2mL待測液（內含 DNA應在標準曲線的可測范圍之內）和4mL二苯胺試劑，搖勻。其余操作同標準曲線的制作。
三、DNA含量的計算
根據測得的光吸收值，從標準曲線上查出相當該光吸收值DNA的含量，按下式計算出制品中DNA的百分含量：