化學發光免疫分析系統分類介紹

什么是化學發光

化學發光：在常溫下由化學反應產生的光，產生電子能級處于激發態的物質，后者通過躍遷釋放能量產生光子，從而導至的發光現象。化學發光是一個多步驟的過程。  

化學發光按照發光時間可以分為：

閃光（Flash）: 發光時間在數秒內，如吖啶酯，以原位進樣(In Situ Injector) 和時間積分法測量。

輝光（Glow）: 發光時間在數十分鐘以上，如：HRP-Luminol系統、AP-AMPPD系統、黃嘌呤氧化酶系統，無須原位進樣，以速率法測量。

什么是化學發光免疫分析

化學發光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA) 誕生于1977年，是近十年來在世界范圍內發展非常迅速的非放射性免疫分析，將高靈敏的化學發光技術與高特異性的免疫反應結合起來建立的微量測定技術，因此該技術靈敏度高、線性范圍寬、應用范圍廣。而且CLIA與放射免疫分析(RIA)、熒光免疫分析(IFA)及酶免疫分析(EIA)相比，操作簡便、反應快速、無放射污染，儀器簡單穩定且可以實現自動化。

化學發光免疫分析系統示意圖

化學發光免疫分析包含免疫分析系統和化學發光分析系統。

免疫分析系統是指：抗原抗體標記化學發光物質或酶，經過抗原與抗體反應形成抗原-抗體免疫復合物。

化學發光分析系統是指：在免疫反應結束后，利用化學發光物質經催化劑的催化和氧化劑的氧化，形成一個激發態的中間體，這種激發態中間體回到穩定的基態時，同時發射出光子，利用發光信號測量儀進行檢測。根據化學發光標記物與發光強度的關系，可利用標準曲線計算出被測物的含量。

    化學發光免疫分析系統分類

根據免疫系統的固相載體進行分類，可將化學發光分為：

• 板式化學發光免疫分析系統，固相載體為微孔板，需要反應時間較長，代表廠家科美、新波等；

• 管式化學發光免疫分析系統，固相載體為微粒子，比較主流的微粒子是微米級別的超順磁微粒。大多數管式化學發光為大型免疫分析系統，代表廠家羅氏、雅培、西門子、貝克曼等。國內已有廠家將管式化學發光應用于POCT。

根據免疫反應狀態進行分類，可將化學發光分為：

• 均相化學發光免疫分析系統：均相條件下反應和檢測，無需分離系統。比如科美光激化學發光系統和西門子德靈系統；

• 非均相化學發光免疫分析系統：主流的化學發光系統，發光檢測前，需要將未反應結合的樣品洗脫分離。   

非均相管式化學發光反應系統示意圖

根據發光體系的不同進行分類，可將化學發光分為：化學發光免疫分析、化學發光酶免疫分析、電化學發光免疫分析法、光激化學發光免疫分析。本文簡單介紹幾種化學發光體系：

化學發光免疫分析（直接化學發光）

化學發光免疫分析（chemiluminescence immunoassay,CLIA），用化學發光試劑直接標記抗體或者抗原的一類免疫檢測方法。

• 魯米諾類標記的化學發光免疫分析：魯米諾類物質的發光為氧化反應發光。在堿性溶液中，魯米諾可被許多氧化劑氧化發光，其中H₂O₂最為常用。

• 吖啶酯類標記的化學發光免疫分析：吖啶酯在H₂O₂和OH^-條件下，能迅速發光，吖啶酯衍生物標記效率高且穩定性好，因此吖啶酯作為標記物用于免疫分析，發光體系簡單、成本低，具有較低本底且能快速檢測。

化學發光酶免疫分析（酶促化學發光）

化學發光酶免疫分析（Chemiluminescent enzymeimmunoassay，CLEIA）屬酶免疫分析，只是酶反應的底物是發光劑。反應步驟：以酶標記生物活性物質進行免疫反應，免疫反應復合物上的酶再作用于發光底物，在信號試劑作用下發光，用發光信號測定儀進行發光測定。目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP )和堿性磷酸酶(ALP)。

•  HRP-H₂O₂-LUMINOL體系：使用過氧化物酶標記抗體，進行免疫反應后，利用魯米諾作為發光底物，在過氧化物酶和起動發光試劑（NaOH和H₂O₂）作用下魯米諾發光，同時加入增強劑，以增強發光信號。

• ALP-AMPPD發光體系：AMPPD在堿性條件下本底很低，熱穩定性好且檢測結果穩定。ALP-AMPPD發光體系具有很較高的靈敏度，已得到廣泛應用。

電化學發光免疫分析

電化學發光免疫分析（Electrochemiluminescence，ECL）是指由電化學反應引起的化學發光過程。ECL的反應在電極表面進行，發光底物為三聯吡啶釕[Ru(byp)2+3 ]，以三丙胺(TPA)來激發光反應，它包括電化學和化學發光兩個過程。ECL的突出優點：標記物非常穩定；發光時間長、靈敏度高、線性范圍寬、反應時間短。羅氏該方法ZL已經于2016年過期，目前國內已經有企業布局該檢測領域。

光激化學發光免疫分析

光激化學發光（Light initiated chemiluminescence assay, LiCA）是以納米級高分子微粒為基礎的新一代化學發光技術。 試劑由含有感光化合物的感光微粒和含有發光化合物的發光微粒組成。LiCA技術的核心原理是高能態離子氧的產生和傳遞，是由光激發產生的均相化學發光技術。它具有低本底、快速、均相（免洗脫）、高靈敏度等優點，但是由于是均相反應，適用于兩步法反應的項目在解決假陽性率和消除HOOK效應方面具有較高研發難度。