化學測序法實驗

醋酸 無水乙醇 硫酸二甲酯 DMS DMS 緩沖液 DMS 終止液 EDTA 甲酰胺 甲酰胺上樣緩沖液 肼 肼終止液 NaCl NaOH-EDTA 溶液 哌啶水溶液 哌啶甲酸 乙酸鈉 聚丙烯酰胺測序凝膠 鮭魚精 DNA 放射標記的目標 DNA 酵母 tRNA

干冰-乙醇浴 切侖科夫（Cerenkov) 記數器冰水浴 小離心管 旋轉真空干燥器 有緊固蓋的循環水浴裝置 凝膠測序裝置及電源可調 37°C 和 90°C 的水浴裝置

材料

溶液和緩沖液

貯存液、緩沖液和試劑的配方請參照附錄 1。

醋酸（1mol/L): 用冰醋酸（17.4mol/L) 現配

無水乙醇：-20°C

硫酸二甲酯（DMS): 濃度 99%(Aldrich; 金色標簽 99%)

DMS(10%V/V) 溶于乙醇中

DMS 緩沖液
50 mmol/L 二甲基砷酸鈉（pH7.0)
1 mmol/I.EDTA(pH8.0)
警告：稱量二甲基砷酸鈉時使用手套和面具，使用 DMS 緩沖液時使用手套。

DMS 終止液
1.5mol/L 乙酸鈉（pH7.0)
1mol/Lβ-巰基乙醇
250ug/ml 酵母 tRNA

EDTA(0.5mol/L,pH8.0)

甲酰胺

甲酰胺上樣緩沖液

肼（95%)
肼（EastmanKodak), 分裝成小份，置于緊密封口的微量離心管中，保存干-20°C。

肼終止液
0.3mol/L 乙酸鈉（pH7.0)
0.1 mmol/LEDTA(pH8.0)
100ug/ml 酵母 tRNA

NaCl(5mol/L)

NaOH-EDTA 溶液：1.2mol/LNaOH 含 1 mmol/LEDTA

1mol/L 哌啶水溶液
應新鮮配制，在刻度玻璃管中用 1 倍體積哌啶（10mol/L;Fisher) 混合 9 倍體積水。

1mol/L 哌啶甲酸
用 10mol/L 哌啶將 4% 甲酸水溶液調至 pH2.0 即可，

3mol/L 乙酸鈉（pH5.2)

膠

聚丙烯酰胺測序凝膠
Maxam-Gilben 測序反應產物通常在 6% 或者 8% 的變性聚丙烯酰胺凝膠上分析（請參考方案 8)。

梭酸和寡梭苷酸

鮭魚精 DNA(lmg/ml) 水溶液
修剪的鮭魚精 DNA 通常被用來作為化學測序的載體。事實上，幾乎所有 DNA 都可以。而修剪的鮭魚精 DNA 可以作為商品買到，同時也可以在實驗室中得到（見第 6 章，方案 10)

放射標記的目標 DNA
標記的片段必須包括最少 5x10⁵Ci/min 的 ³²P, 溶于水中可至 5000Ci/min/ul(細節請見補充方法：制備化學測序中的末端標記 DNA)。DNA 溶液必須無鹽。如果放射性標記的 DNA 有限. 有時可以只進行 5 反應流程中的 4 個（C、C+T,A+G、G) 就得到序列結果。

酵母 tRNA(1 mg/ml 水溶液）

特殊裝置

干冰-乙醇浴

切侖科夫（Cerenkov) 記數器（見附錄 8)

冰水浴

小離心管
切割反應通常在標準 1.5 ml 小離心管中進行。當同時進行不同實驗時，可用不同顏色的管以區分。有些研究者使用硅處理過的管。其實這一措施并不必要，只需在每步沉淀后都將 DNA 徹底溶解即可。例如，可用 Tip 頭吸取緩沖液徹底沖洗管壁，或延長渦旋振蕩的時間。

旋轉真空干燥器
如 SavantSpeedVac。

有緊固蓋的循環水浴裝置
例如 ResearchProductsInternational 產品。
選用，見第 4 步。

凝膠測序裝置及電源
參見方案 11。

可調 37°C 和 90°C 的水浴裝置

方法

1. 準備好放射性標記的DNA, 依表12-16的流程圖操作。
通常只進行流程中的4個反應（C,C+T,A+G,G)就可得到序列結果。

2. 在以上4或5個包含修飾堿基的凍干的DNA樣品中加入100ul 1mol/L哌啶，用渦旋振蕩器重懸。
哌啶用來切斷DNA鏈上化學修飾位點的糖-磷酸鍵。

3. 蓋嚴管口，用渦旋振蕩器混勻。如果需要，稍離心（2000r/min)使混合物聚集于管底。

4.90°C孵育30 min。為防止管蓋彈開，可以在管上壓上重物，或用塑料膠帶封住管口, 或在有緊固蓋的循環水浴裝置中反應。

5. 等管冷卻到室溫，打開蓋子，用石蠟膜（Parafilm)封上打開的管子，用21號針頭在石蠟膜上刺幾個孔。在旋轉真空干燥機上將其抽干。
為避免最后的測序膠上條帶模糊不清，必須徹底去除堿基持異切割反應中的哌啶。最好在凍干的情況下使用旋轉真空干燥機。依抽干機效率而言，此步常需要1~4小時。一些研究者傾向于在抽干前用干冰-乙醇溶冷凍樣品。

6. 取出小管。去除石蠟膜并加入20ul水。蓋上管蓋，渦旋振蕩30s溶解DNA。稍離心使溶液聚集在管底。使用手持微型計數器計數以確認管壁上的標記DNA已經完全被溶解在了水溶液中。

7. 重復一次，在旋轉真空干燥機上將其抽干，這一步依抽干機效率常需要15~30 min。
(參照第5步）。




8. 重復步驟6和7。
為了確保哌啶被完全除去. 一些研究者傾向于再次將DNA溶于10ul水并抽干。可是, 一般而言，只有在樣品呈油狀或者需要很長的抽干時間時才需要進行這一步。

9. 用切侖科夫（Cerenkov)記數器估計管中的放射活性，把修飾并切割后的反應物于測序膠緩沖液中。在柯達XAR-5膠片上的過夜曝光時，在一個堿基之后的切割反應物需要大約25000cpm(C和G 反應），在兩個堿基之后的切割反應物需要大約50000cpm(C+T，A+G,A>G)。所以，溶解在測序緩沖液中的C和G反應物要達到25000cpm/3ul; 而C+T,A+G和A>G反應物要達到 50000cpm/3ul。渦旋混合物使 DNA 完全溶解，稍離心使混合物聚集于管底。樣品可在-20°C 保存數小時。

10. 在 90°C 加熱 lmin 使 DNA 變性，在冰上驟冷。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結果（參見方案 8，9,10,11 和 12)。