單核苷酸多態性（SNPs）鮭魚基因型的高通量分析

在美國阿拉斯加州，對于鮭魚產業的良好管理具有極大的經濟價值。單核苷酸多態性基因分析在衛生保健領域已有廣泛應用，但在農業生物領域并不多見。本文闡述了單核苷酸多態性基因型檢測在阿拉斯加的漁場管理者維持健康野生太平洋鮭魚數量方面的應用。

For the state of Alaska, good management of salmon fisheries is of enormous economic importance. SNP genotyping is usually encountered in the field of health care, not in the area of AgBio, but the applications of SNP genotyping assays are helping Alaska’s fishery managers maintain robust populations of wild Pacific salmon.

        美國阿拉斯加州是世界上最佳的漁場之一，大量生產味道鮮美、益于健康的野生鮭魚。為了幫助阿拉斯加漁場管理者維持健康鮭魚的數量，阿拉斯加漁政部（ADF＆G）投資，從美國應用生物系統公司（Foster City, CA）引進了自動化基因分析技術。在阿拉斯加漁政部基因保護（gene conservation）的實驗室里，一群科學家和技術人員在首席科學家James Seeb 博士的指導下，為坐落于阿拉斯加灣的多個漁場進行魚群組成和遷徙的研究。利用從應用生物系統公司購買的高通量TaqManR單核苷酸多態性（SNPs）基因檢測儀和實時多聚酶鏈式反應（PCR）系統，Seeb 博士領導的研究小組幫助漁場管理者們維持健康野生的太平洋鮭魚的數量。

　　利用高通量SNP 基因檢測儀，阿拉斯加漁政部的科學家可以對更多的魚進行檢測以獲得其基因序列，從而為漁場管理者提供更多具有重要商業價值的關于鮭魚種群組成和遷徙模式的信息。利用這些信息，漁場管理者可以預測不同捕撈區內魚群的組成、魚苗成長過程中的遷徙路線以及評估環境對魚群數量的影響。

　　通常捕撈的鮭魚魚群由不同種類的鮭魚組成。每種鮭魚可能來自于許多不同的河域，數目也不盡相同。當魚群數量不足時往往需要暫時對其進行保護，例如成功地管理漁場或將魚群混聚在一起保護單股魚群，使之免受自然力和人類的危害。

1 鮭魚種類的多樣性

　　在美國阿拉斯加州，有5 種太平洋鮭魚：紅鮭、狗鮭、國王鮭，粉紅鮭和銀鮭。它們不僅是生態系統的基本成員，也是阿拉斯加州漁業的主要產品。實際上，阿拉斯加州憲法中有一項條款要求每年需將一定數量的鮭魚放回淡水產卵區產卵（見圖1 和圖2 ）。

　　雖然粉紅鮭的年產量占阿拉斯加州鮭魚年產量的6 0 ％以上，但它們主要是被加工成廉價的罐裝魚制品。紅鮭的平均產量占阿拉斯加州鮭魚產量的22％，狗鮭占11％。與之不同的是，國王鮭年產量只有鮭魚總量的3 ％。因此，更為稀少的野生國王鮭在魚產品市場售價高達每鎊15 美元也絲毫不會令人感到驚訝。與之相比，養殖的大西洋鮭魚售價僅為每鎊6美元。

　　狗鮭在所有太平洋鮭魚中分布范圍最廣，由西太平洋的韓國海域開始，貫穿阿拉斯加海灣直至美國西北的太平洋海域都可以找到。據Seeb 博士介紹，世界上所有的狗鮭都沿著阿拉斯加半島南海岸進行遷徙，該區域有一條海峽將阿拉斯加灣和白令海連接在一起。盡管對漁民而言，狗鮭并不如國王鮭和紅鮭珍貴，但它卻是許多阿拉斯加本土人生活中必不可少的食品[1 ]。

2 捕魚區域的管理

　　鮭魚卵在淡水河流進行孵化，產生的魚苗會向海洋遷徙，成魚最終再返回其聚居的河流中產卵。可以通過分子標簽對某一魚群游經的路線進行標記，并借助這種方法對鮭魚種群的遷徙路線繪圖研究。

　　了解鮭魚在哪里出現、以及何時出現可以幫助漁場管理者更清楚地知道為什么某種鮭魚被捕獲的頻率遠高于其他種類。例如，一種鮭魚遷徙到目的河流的距離往往決定了其被捕撈的幾率。利用基因分析技術，Seeb 博士領導的研究小組為這些管理者提供不同捕魚區內捕獲的魚群中鮭魚的種類分布數據。

　　阿拉斯加漁政部所屬的商貿漁業部負責控制市場銷售所需的鮭魚捕撈量。Seeb 博士的實驗室受其邀請為漁業管理者做報告，內容包括用于區分不同魚種的基因分析數據。

　　Seeb博士實驗室的研究人員從鮭魚DNA樣本中獲得等位基因出現頻率的數據，并用這些數據鑒定漁場捕撈到的魚群狀況。阿拉斯加漁政部根據漁場提供的鮭魚數量建議其開放或關閉不同的捕撈區域，指導商業捕撈船到達魚群豐富的流域而避免在魚群稀少的水域進行作業。基因分析數據還有助于漁場管理者預測不同捕撈區域特定魚群的數量，這樣既能幫助漁場捕撈到充足的產品，又能維持足夠數量的魚回歸自然。

3 用分子標記鑒定鮭魚

　　三十多年來，漁場管理者一直依賴分子標記評估混合魚群中不同種類的鮭魚數量和來源，以及它們在海洋中的分布和遷徙模式。科學家們先要選擇某種分子標記幫助他們建立不同種類鮭魚的等位基因頻率基準，所選的分子標記通常包括： 異構酶、線粒體DNA（mtDNA）、聚合酶鏈反應- 限制片段長度多態性（RFLPs）和DNA 微衛星序列。環境保護遺傳學家通過跟蹤等位基因頻率的差異預測不同鮭魚的遷徙模式。在過去十五年里，科學家們已經逐漸轉用SNP 標記對魚群遷徙和組成進行研究。

　　阿拉斯加漁政部的科學家們發現，SNP標簽（所有生物基因組DNA 中單個堿基變化的譜圖）比其他DNA 鑒定標記更易于進行實驗室間的信息交流。與其他基因標記相比，SNP使世界上不同實驗室間的數據比較更加準確[2]。

　　據Seeb 博士介紹， TaqMan SNP 基因檢測儀能夠極大地提高基因分析測試的速率，從而允許對大量的魚類樣品進行分析。此外，SNP分析可以進行活體檢測，而此前的技術需要將魚殺死。

4 等位基因酶標記的缺陷

　　最初使用分子標記的時候，遺傳學家使用等位基因酶（代謝途徑中同一酶的不同構型）對大多數鮭魚種群進行研究。盡管等位基因酶有助于研究人員鑒定某一種群內個體的基因差異，可是使用等位基因酶數據用于鮭魚種群和遷徙的研究卻存在一些不足。缺憾之一是這種標記僅僅來源于大約40個不同的基因，并且只有少許染色反應可以對這些基因的酶產物進行染色。使用等位基因酶的另一個缺點是基因型檢測很難自動地將其轉變為遺傳標記。而且，為了獲得新鮮的或者凍存的組織（分析檢測采集等位基因酶標記數據所需）首先需要將魚殺死。除了上述缺陷以外，使用等位基因酶還需要非常多的遺傳標記才能辨別出太平洋鮭魚種群間的差異。

5 微衛星序列

　　微衛星序列是生物基因組非編碼區不同大小的DNA 片段，也是遺傳標記的一種，可以為科學家提供豐富的用于辨別鮭魚種群的可變標記。對于基因分析而言，微衛星等位基因的數量可以達到每個位點80個以上，如此多的微衛星等位基因可以為科學家提供更多的標記差異，因此與等位基因酶標記（通常只有兩個特征序列）相比，具有更強的區分魚類種群能力。

　　然而與等位基因酶數據不同的是，微衛星序列的數據不利于實驗室間的數據交流。對種群研究而言，微衛星序列中增加的類似于等位基因酶的等位基因數量實際上阻礙了基因分析數據在實驗室間的共享。全球不同的實驗室用于分析和采集微衛星等位基因所采用的化學反應和儀器平臺各不相同。例如，微衛星分析過程中，研究人員利用所使用的工具估計堿基對的長度和重復單位的數目，以此鑒定每個標記。這些估計值具有實驗室特異性，甚至在同一實驗室環境中，不同的平臺或儀器可能產生不同的DNA長度估計值。這種實驗室與實驗室之間的DNA 片段長度估計值的差異讓科學家們很難使用微衛星數據建立多個實驗室用于鮭魚基因分析的共同標準。

6 SNP檢測技術的應用促進了鮭魚基因分析技術的發展

　　與研究一段堿基的微衛星標記相比，SNP數據是一組組的堿基對。這樣，研究人員在利用分析工具采集SNP 序列數據的時候只會遇到4 種可能：A，C，T 或G。因此，在不同實驗室以及在各種不同的化學儀器平臺上可以對單核苷酸序列自動地進行標準化處理。

　　科學家們最初將DNA測序和片段分析的混合物作為樣品，利用SNP 分析方法對鮭魚基因進行測定，這是一種耗時的方法。最近，這一技術得到了發展，可以通過熒光定量方法高通量、快速地進行SNP基因分析。

　　熒光定量SNP 基因型檢測技術利用熒光探針同時擴增并測定鮭魚DNA樣品，而不必在PCR 以后再進行電泳分析。通常，一小片鮭魚鰭就能為科學家提供足夠多的D N A 樣品進行單核苷酸基因型檢測，從而鑒定出某種鮭魚種群遷徙經過哪個漁場。使用SNP 基因型檢測可以將收集到的D N A 樣品轉化成數據庫收錄的種群鑒定標記。

　　實時PCR系統，例如7900HT 實時PCR 系統（美國應用生物系統公司），可以自動記錄個體基因型并生成描繪有各個等位基因特異性探針數量的散點圖，每個基因特異性標記都與相應個體基因分析的PCR 產物相關聯。使用種群統計軟件程序，研究人員能夠將經過基因分析的未知樣品歸類于其最有可能的種群。包括Seeb 博士在內的一些研究人員最近在對國王鮭進行基因分析時認為，通過實時熒光定量檢測產生的SNP 數據只能擬合為一條單鏈PCR 產物的信息，并且PCR 產物中每個位點只有兩個等位基因存在，這樣就不需要再進行電泳分析（實驗室間數據不協調的可能原因）。如此檢測到的所有等位基因都有助于檢測的便利實施以及隨后實驗室間數據的共享[2]。

　　研究人員使用裝有384孔熱循環反應模塊的7900HT系統對國王鮭進行研究。一個技術人員每天8 小時內進行3 次這種檢測就能產生并記錄下2280 個基因型。這一研究的創始人指出，通過增加更多的外部熱循環模塊可以顯著提高檢測效率[2]。并且，以增加外部熱循環的方式對儀器進行簡單的調整，就可以使熒光定量檢測的通量能夠滿足實驗室的需要。

　　Seeb 博士指出，使用同樣的SNP 基因型檢測方法，他的實驗室每天可以自動地檢測至少20000 個基因型（見圖3 和圖4）。熒光定量基因型檢測作為終端檢測在運行的時候允許利用外部熱循環反應器進行熱循環反應，然后通過7900HT系統獲得結果。一個完全自動化的實驗室利用一臺7900HT 系統和幾個384 孔熱循環反應器可以進行200,000 多個基因型的檢測分析。國王鮭研究的發起者斷定，SNP基因型檢測的高通量加上其數據便于交流的特點預示SNP 將會成為用于鮭魚種群和遷徙研究的最重要工具[2]。

 

7 太平洋鮭魚DNA序列信息的采集

　　研究人員發現的鮭魚SNP 序列越多，就越有可能估計出某種特殊魚群或漁場中未知來源鮭魚的種類，并能更好地區分不同的魚種，提供更好的魚群分組結果。為了將鮭魚基因組D N A 序列信息轉換成太平洋鮭魚S N P 基因分析標記，阿拉斯加漁政部的研究人員使用一種間接方法來發現S NP，這種方法需要將大西洋鮭魚和彩虹鮭魚的基因組D N A 序列數據結合起來[3]。

　　奇怪的是彩虹鮭魚和太平洋鮭魚屬于同一種類，有著幾乎相同的基因信息。由于大西洋鮭魚和彩虹鮭魚的大部分基因序列已被測定，Christian Smith 博士（Seeb 博士實驗室的一位遺傳學家）發展了一種用于發現共同序列區域的新方法，共同序列可以用于設計對太平洋鮭魚SNP 進行鑒定的引物序列。為了找到太平洋鮭魚SNP 序列的起始位點，Smith 博士對彩虹鮭魚和大西洋鮭魚的D N A 序列的排列方式進行比較。當兩段序列一致時，這一相同序列也極有可能存在于某種太平洋鮭魚中。通過這種方法，Smith 博士發現了一種太平洋鮭魚SNP序列（每隔300個堿基對出現一次）。

8 環境對鮭魚種群的威脅

　　有多種因素導致太平洋鮭魚不同種群間數量的極大波動，這些因素包括：歷史周期，過渡捕撈，全球氣候變化，孵卵區疾病的發生以及由于采礦、伐木、筑壩和鋪路等導致的逐漸惡化的生存環境。據Seeb 博士介紹，阿拉斯加布里斯托爾海灣內的紅鮭正處于其歷史周期中數量豐富的階段，在過去100 年里，野生紅鮭成魚的數量最少不足50 萬尾，最多可達4 千萬尾。

　　全球氣候變化可能已經導致了大片圓石藻的出現，這會使某些鮭魚數量減少（見圖5 ）。這些既大又厚的海藻區以一種不穩定的形式存在，它們離開阿拉斯加西海岸后在海面連綿幾英里，以至陽光不能照入水下。由于鮭魚賴以為生的浮游生物在這種沒有陽光的環境下不能生長，從而導致遷徙至海藻區下方的鮭魚被餓死。漁場管理者現在可以利用SNP 基因分析數據研究哪種鮭魚比其他魚種在遷徙經過海藻區時更易于受到死亡的威脅。

9 SNP基因分析數據的價值

　　對鮭魚遷徙和魚群組成研究而言，收集處理可靠的鮭魚SNP 數據有助于科學家們建立標準的遺傳標記數據，這些數據既可以用于鮭魚基因分析又可以促進實驗室間數據的共享，從而降低研究成本。SNP 遺傳鑒定標記將會有效地幫助環保遺傳學家更好地鑒別和管理多種野生太平洋鮭魚混雜在一起的魚群。

參考文獻:

Smith CT, Baker J, Park L, Seeb LW, Elfstrom C, Abe S, Seeb JE. Characterization of 13 single nucleotide polymorphism markers for chum salmon. Molec Ecol Notes, 2005, 5: 259-62.

Smith CT, Seeb JE. Use of the 5’nuclease reaction for single nucleotide polymorphism genotyping in chinook salmon. Transactions of the American Fisheries Society, 2005, 134: 207-17.

Smith CT, Elfstrom CM, Seeb LW, Seeb JE. Use of sequence data from rainbow trout and Atlantic salmon for SNP detection in Pacific salmon. Molec Ecol Notes, 2005, 13: 4193-4203.