原代胚胎成纖維細胞培養

細胞培養是模擬機體內生理條件，將細胞從機體內取出，在人工條件下培養，使細胞生存、生長、繁殖和傳代，從而可以進行細胞生命過程、細胞癌變等問題的研究。由體內直接取出組織或細胞進行細胞培養叫做原代細胞培養，也有的把第1代細胞與傳10代以內的細胞培養統稱為原代細胞培養。一般來說，用幼嫩狀態的組織和細胞，如動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進行原代培養。

原代鼠胚胎成纖維(MEF)細胞目前最大的用途是用來支持干細胞的培養。在培養鼠胚胎干細胞時，常常需要用分裂能力被抑制的原代鼠胚胎成纖維細胞作為輔助細胞來支持干細胞的生長并防止干細胞的分化。這些原代鼠胚胎成纖維細胞通常分裂兩代后就停止分裂，所以需要經常制備新鮮的原代鼠胚胎成纖維細胞。

孕鼠

PBS 胰酶 EDTA DMEM FCS

手術小直剪刀 眼科直鑷子 眼科彎鑷子 玻璃平皿 尼龍濾網 離心管 手術刀片

1. 將解剖用的剪刀、鑷子和刀片進行無菌消毒。

2. 將懷孕小鼠用頸椎脫位法處死，將其固定在解剖板上。

3. 用70％乙醇噴灑在小鼠的腹部進行消毒，用一把剪刀和一把鑷子把孕鼠外皮剪開，用另外一把剪刀和一把鑷子把內皮剪開，露出子宮，最后用第三把剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。

4. 用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內臟，將其余胚胎轉移到一個裝有30 mLPBS的50 mL離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉PBS，再重復此步驟一次，留少許PBS，將胚胎轉移到另一裝有PBS的平皿中，用手術刀片將其切碎至可用微量移液器吸取。

5. 用200μL的微量移液器反復快速吹打平皿中的液體，放在15 mL離心管中，

4℃ 1500 r／min離心5 min，倒掉上清液，加10 mL胰蛋白酶，重懸沉淀，37℃水浴中消化30 min，且每隔5 min輕輕晃動，使之充分消化。

6. 將上層細胞懸液倒入一裝有10 mL DMEM培養基的50 mL離心管中，用200

目尼龍濾網過濾后，1 500 r／min離心5 min，棄去上清液。

7. 用移液管吸取30 mL DMEM培養基，讓培養液沿離心管壁緩緩流入管底，

1 500 r／min離心5 min，棄掉上清液。重復一次此步驟。

8. 將細胞沉淀用15 mL培養基懸起。細胞計數(8只14天胎鼠可獲得(2～3)×107個細胞)。

9. 將3×106個細胞懸浮于15 mL含10％小牛血清的DMEM培養基中，接種到

200 mL的培養瓶中。

10. 24 h后更換新鮮的含10％小牛血清的DMEM培養基。

11. 細胞長滿后，棄掉培養基，用PBS小心沖洗，倒掉，加胰蛋白酶消化。

12. 輕輕晃動細胞培養瓶，見有細胞浮起，立即加入2 mL血清終止消化，用移液管把細胞輕輕懸起，混勻，使細胞成為單細胞懸液。

13. 1500 r／min離心5 min。棄掉上清液。加入10 mL含小牛血清的DMEM培養基，懸起細胞，按1：5傳代。

14. 細胞再次長到覆蓋率80％～90％，將其消化后，常規凍存(凍存液要現配)。

15. 實驗結果：可拍照存留。

1. 解剖小鼠時要注意無菌操作。

2. 用胰蛋白酶進行消化時，要隨時觀察，避免過度消化。

來源《現代生物技術概論》