原核表達之目的基因克隆

1. 了解實驗課題對目的蛋白的要求

包括：目的蛋白分子量有多大，表達目的（是蛋白結晶、藥劑結合還是制備抗體，不同目的對蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞內表達還是分泌表達，是組成型表達還是誘導型表達；另外，還要了解蛋白表達后需要采用什么樣的方式進行純化，純化標簽有多大，蛋白純化后是否需要將標簽去除（即標簽的存在是否會影響蛋白的活性）。

還要對目的蛋白進行稀有密碼子（僅限于真核生物基因通過原核表達系統表達時參考，注意稀有密碼子的多少，位置5位或3位，稀有密碼子是否成串出現等）和可溶性網上預測等。

稀有密碼子預測網址：

http://molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_11.html

http://www.faculty.ucr.edu/~mmaduro/codonusage/usage.htm

http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/

http://www.doe-mbi.ucla.edu/~sumchan/caltor.html

原核表達蛋白可溶性預測網址：

http://www.biotech.ou.edu/

綜合以上，選取合適的表達載體及宿主菌。

注意：不是所有的標簽都是用來純化蛋白的，有的標簽有促進蛋白溶解的作用，有的則是二硫鍵形成或利于表達后蛋白的檢測。

一般我們最常用的是胞內誘導型表達（即蛋白翻譯后是存在于細胞內，通過加誘導物的方法來控制表達水平）。

2. 搜索要表達的目的基因的序列，根據其編碼區序列來設計引物；

注意：要注意在引物上加入限制性內切酶識別位點（首先應分析蛋白編碼區內是否含有相同的內切酶識別位點），并通過查閱資料看兩種酶（上下游引物分別加入酶切位點）是否可以在同一反應體系中起作用，并注意標簽序列是在N端還是在C端，若要在C端保留標簽，則需要將下游引物的終止密碼子替換掉；若要在引物上引入標簽序列，則引物上應加入標簽序列堿基（即在上游引物或下游引物處引入His的密碼子）；另外，還要注意引物不能造成蛋白的編碼框發生改變；

1，2步的分析至關重要，只有在完成前兩步的工作后才可以進行后續的實驗操作。

3. 搖菌，進行RNA抽提（注意選取不同表現型的菌株），搖菌的時間一定不要太長，太長的話RNA活性不高；

4. mRNA反轉成cDNA（此步應在第三步完成后立即操作，RNA存放時間長易降解）；

5. 以cDNA為模板，利于設計好的引物進行PCR擴增；

6. 通過膠回收試劑盒回收目的DNA片段。