雙脫氧法DNA測序實驗

實驗材料 DNA

試劑、試劑盒 寡核苷酸引物測序酶終止混合液測序酶緩沖液焦磷酸酶混合液

儀器、耗材 離心機離心管微量滴定板

實驗步驟

1.  對于每個單鏈模板：將下列試劑混合于0.5 ml 微量離心管中

（1）0.5 pmol 單鏈DNA模板

（2）0.5 pmol 引物

（3）1 μl 10×測序酶緩沖液

（4）加水至10 μl

（5）用吸管上下抽吸輕輕混勻（避免產生氣泡）。于65℃溫育6 min，然后于37 ℃溫育20 min，轉到步驟3。

2.  對于每個雙鏈DNA模板：以下列混合液重溶含0.5 pmol 變性雙鏈模板的干燥沉淀物。

（1）1 pmol 引物

（2）1 μl 10×測序酶緩沖液

（3）加水至10 μl

（4）用吸管上下抽吸輕輕混勻（避免產生氣泡），于37℃溫育30 min，然后在此退火溫度下放置直至進行步驟3。

3.  當引物正和模板退火時，對應每個待測模板，分別標記好A、C、G、T 4個微量離心管。

DNA測序用酶的特性

3.  分別加入2.5 μl A、C、G、T 測序酶終止混合液至A、C、G、T管的底部

4.  在臨用前，才用測序酶稀釋液稀釋測序酶/焦磷酸酶混合物至1~ 2 U 測序酶/μl，置于冰浴。

5.  將下列試劑加入已退火的引物和模板中

（1）2 μl  標記混合物

（2）0.5~1.5 μl  10 mCi/ml［α-32P］dATP

（3）2 μl  稀釋的測序酶/焦磷酸酶混合液

（4）總體積在14.5~16 μl，于25℃（室溫）溫育5 min。

6.  加入3.5 μl 標記反應物至含測序酶終止混合物A的微量離心管中。

7.  用吸管上下抽吸輕輕混勻，對 A、C、G、T 管重復此過程，每次均需更換吸頭，于37℃溫育5~10 min。

8.  加入4 μl 終止/加樣染料液，于95℃水浴2 min，然后置于冰浴。

9.  每樣品各取2~3 μl 加樣于測序膠進行凝膠電泳并讀出序列。