試劑、試劑盒 DEPC處理的水 轉錄緩沖液 lOOmmol LDTT RNasin rATPrCTPrUTP rGTP0.5 mmol L m7 G(5＇)ppp(5＇)G DNA 模板 RNA 樣品緩沖液 RNA 載樣緩沖液 MOPS 緩沖液 TE 緩沖液
實驗步驟
一材料與設備
1)DEPC：處理的水
2) 轉錄緩沖液（5X):200 mmol/LTris-HCI(pH7.9),30 mmol/LMgCl2,lOmmol/L. 亞精胺，50 mmol/LNaCl
3)lOOmmol/LDTT
4)RNasin
5)rATP,rCTP，rUTP，各 2.5 mmol/L
6)rGTP0.5 mmol/L
7)m7 G(5＇)ppp(5＇)G,5 mmol/L
8)DNA 模板，1?2 mg/ml
9)RNA 樣品緩沖液：10 mmoL/I. 去離子甲酰胺，3.5 ml37% 甲醛，2 mlMOPS 緩沖
液
10)RNA 載樣緩沖液:50% 甘油，lmmol/LEDTA，0.4% 溴酚藍,lmg/ml 溴化乙錠
11)MOPS 緩沖液：0.2 mmol/LMOPS(pH7.0),50 mmol/L 乙酸鈉,5 mmol/LEDTA(pH8.0)
12)TE 緩沖液
二操作方法
1) 體外轉錄生成 RNA
在無菌離心管中，室溫下加入下述成分:
5X 轉錄緩沖液 4ul
100 mmol/LDTT 2ul
RNasin20U
rATP,rUTP,rCTP(各 2,5 mmol/L) 4ul
GTP(O.5 mmol/L) 2ul
m7 G(5＇)ppp(5＇)G(5 mmol/L) 2ul
DNA 模板 (1?2 mg/ml) 1-2ug
加無核酸酶的水至終體積 19ul
2) 起始反應加入 1ul SP6、T7 或 T3RNA 聚合酶（15?20U/ul)。
3)37?40℃ 孵育 60 min。
4) 按 RNA 標準轉錄反應所述的方法除去 DNA 模板，純化 RNA 轉錄物。