同濟大學劉琦教授Cell子刊探討CRISPR的insilicosgRNA設計

　　CRISPR/Cas9系統是目前進行基因編輯的有效技術。實現CRISPR/Cas9系統的核心問題之一是進行高效以及特異性的sgRNA設計。近日，同濟大學生命科學與技術學院劉琦教授課題組受邀在Cell子刊，Trends系列著名雜志《Trends in Biotechnology》（影響因子：12）發表論文，系統探討了CRISPR基因編輯系統中的in-silico sgRNA設計問題。

　　劉琦教授課題組以數據挖掘和機器學習計算技術為基礎，重點關注于生物醫藥大數據挖掘領域的交叉問題研究，在基因編輯的小RNA設計以及腫瘤精準醫療，多組學數據分析以及藥物基因組學、藥物信息學領域進行了一系列的研究工作。這工作的第一作者為生命科學與技術學院的直博二年級學生啜國暉，項目得到了國家自然科學基金和上海市科委的資助。

　　CRISPR/Cas 是細菌和古生菌抵抗病毒或外源質粒入侵的獲得性免疫系統，其中最常用的II型系統能編碼tracrRNA(Trans-activating crRNA)，指導 RNaseIII和 Cas9 完成前體 crRNA 的成熟，然后tracrRNA 與成熟的 crRNA 的互補序列配對形成 RNA 二聚體，作為向導 RNA(Guide RNA,gRNA) ，引導 Cas9 蛋白識別和降解入侵的外源 DNA。通過人工設計，研究者將tracrRNA/crRNA 二聚體改造成單一向導 RNA(Single guide RNA， sgRNA)，極大方便了基因組編輯技術的研究。

　　此前劉琦教授曾與溫州醫科大學眼視光重點實驗室的谷峰教授合作，通過計算手段，整合多細胞系的基因敲除后的高通量測序數據，基于可靠的統計檢驗，系統研究了多細胞系下CRISPR/Cas9系統基因敲除過程中microhomology和in-frame mutation發生率之間的關系，澄清了前人工作中關于microhomology pattern和in-frame mutation occurrence密切相關的結論（Kim J.S. et al, Nature Methods, 2015），并且進行了實驗驗證。

　　在此基礎上，研究者首次總結出了當前最全面的CRISPR基因編輯計算工具列表，包含36個in-silico sgRNA設計工具以及7個基因編輯測序數據分析平臺。這些工具涵蓋了

　　（1）in-silico on-target設計；

　　（2）in-silico off-target設計；

　　（3）CRISPRi/a設計

　　（4）posterior CRISPR數據分析以及CRISPR screening分析等方面，并從平臺設計及計算方法等角度對這些工具進行了系統的評價和討論。

　　基于上述總結，研究者進一步指出了該領域的若干重要研究問題和方向，包括：

　　（1）系統的比較不同CRISPR系統以及不同工具在不同細胞系下的設計特異性和靈敏度；

　　（2）不同細胞系下的sgRNA設計存在不一致性；

　　（3）發展有效的CRISPR脫靶檢測技術，進一步評估CRISPR系統的脫靶率，

　　（4）開發面向特異細胞系及細胞環境的CRISPR設計技術和方法等。