“嗜血”的質譜

　　衛生部臨檢中心組織的2018年第一次臨床微生物室間質評已經結束，但關于流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌的鑒定問題，在微信朋友圈里談得正熱烈 (見文《溶血 or 流感？傻傻分不清？》)[1]。主要是因為在這次質評中，生化鑒定儀和有些品牌的質譜儀的鑒定結果出錯了。令小布自豪的是，布魯克MALDI Biotyper質譜的鑒定結果與標準答案完全相符！所以小布在這里來一段點評。

　　流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌雖然同屬，但屬于兩個不同的種，致病性和臨床意義也大不相同，前者是上呼吸道感染的常見致病菌，而后者是上呼吸道的正常定植菌。小布認為要認真、仔細地把它們區分開，千萬不要混淆！

　　可是這兩種菌的親緣關系很近，用傳統的形態學和生化方法難以區分。雖然產莢膜的流感嗜血桿菌可以通過莢膜腫脹實驗區別于溶血嗜血桿菌，但有些流感嗜血桿菌是不產莢膜的，通常被認為是無法分型的。同樣，雖然有的溶血嗜血桿菌能夠通過衛星試驗觀察到溶血環，但不是所有的溶血嗜血桿菌都能觀察到明顯的溶血環。

　　難道就沒有好辦法了嗎？當然不是！

　　質譜是區分流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌的好方法

　　早在2013年中國CDC的研究人員就通過質譜圖的聚類分析，發現質譜可以把流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌清楚地分成兩類，甚至可以把不同地區來源的菌株進一步細分（見圖1）[2]。

▲圖1. 流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌的聚類分析樹狀圖（MALDI Biotyper結果）

　　2014年荷蘭公共衛生區域實驗室、荷蘭醫學中心與布魯克微生物研發中心共同發表了MALDI Biotyper能夠正確鑒定流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌的文章 [2]，專家們通過分析不同來源的277個菌株，發現質譜法與測序法鑒定流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌的結果幾乎完全一致（見表1）。

▼表1.流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌的MALDI Biotyper質譜法與測序法鑒定結果比較

　　另外，布魯克公司在美國FDA注冊進行臨床試驗的結果顯示：通過對74個流感嗜血桿菌和31個溶血嗜血桿菌的檢測MALDI Biotyper質譜法鑒定100%正確！（結果摘自布魯克公司提交美國FDA的報告）

　　可見，質譜是區分流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌可以信賴的方法！有些老師不免心生疑問：既然布魯克質譜的鑒定結果都是正確的，那為什么其它品牌的質譜鑒定錯了呢？

　　質譜法的數據庫和鑒定結果的算法非常重要

　　原來呀，質譜鑒定微生物時，需要通過軟件拿采集到的樣品“蛋白指紋圖”到數據庫里進行逐個比對，因此，數據庫建立與比對時所采用的理念與算法，以及數據庫的容量，是影響鑒定結果非常重要的因素。

　　布魯克MALDI Biotyper的建庫理念是以菌株為單位，數據庫中每個條目都是一個獨立的菌株。它的比對算法是采用指紋識別中的“模式識別”算法，就是把樣品的“蛋白指紋圖”與數據庫中所有菌株的“蛋白指紋圖”快速自動地進行逐個圖逐個峰的比較，看看每對比對的“蛋白指紋圖”之間有哪些峰是匹配的，哪些峰是不匹配的，以及匹配的譜峰之間相對強度的相關性，從而得到一個綜合的匹配分數，并根據分數值告訴我們鑒定的可信程度。

　　MALDI Biotyper的算法看上去通俗、簡單，正可謂“大道至簡”吧，不僅非常實用！而且最大程度上避免了誤判！就像警察通過指紋比對來識別罪犯一樣，只要數據庫里有罪犯的指紋，它就能正確地識別出罪犯；即使數據庫里沒有罪犯的指紋，它也不會找錯，只是告訴我們當前數據庫里沒有匹配的指紋，只要擴大搜索數據庫的范圍，定會讓罪犯無以循形，不會造成冤假錯案！

　　有些老師可能會問：我們是做菌種鑒定，MALDI Biotyper的數據庫為什么不以菌種為單位，而是以菌株為單位建立的呢？難道它能鑒定到菌株嗎？

　　大家知道，微生物種類繁多，每種微生物又包含豐富多樣的不同菌株，而同一菌種內不同菌株之間的差異是天然存在的，并和微生物的種類有關，有的種內差異大，有的種內差異小。所以，布魯克決定在菌株水平上建庫，并在選擇每個菌種的建庫菌株時，盡可能包含差異大的菌株，而剔除差異小的菌株。MALDI Biotyper在菌株水平建庫，具有以下優勢：

　　給代表性菌株預留了充分的覆蓋范圍

　　避免了數據庫不必要的冗余

　　容易實現數據庫的擴充和更新

　　能快速適應分類學的改變

　　充分發揮了質譜技術分辨能力遠遠高于傳統方法（如生化方法）的特點，不丟失種水平之內菌株之間的差異。

　　正是由于上述優勢，美國CDC、加拿大國家微生物實驗室和美國NIH等多家機構也在采用布魯克的儀器和理念建立數據庫并對外開放。

　　通過以上對布魯克MALDI Biotyper質譜的數據庫與軟件算法的簡單介紹，相信各位老師就能理解為什么這次衛生部的質評中，布魯克質譜的鑒定結果是正確的，也就很好理解為什么美國FDA批準Bruker MALDI Biotyper CA系統作為首個鑒定新型致病菌耳念珠菌(C. auris) 的新方法了[4-6]。

　　參考文獻

　　1. 溶血 or 流感？傻傻分不清？

　　https://c.eqxiu.com/s/6dAX1boG?eqrcode=1&share_level=6&from_user=a47bf425-c9ee-4022-8d20-723cdc65da79&from_id=6c1c98a1-4d90-42cf-9253-0c244a94e084&share_time=1526295678607&from=groupmessage&isappinstalled=0

　　2. B. Q. Zhu, D Xiao et al. MALDI-TOF MS Distinctly Differentiates Nontypable Haemophilus influenzae from Haemophilus haemolyticus.PLoS One. 2013； 8(2): e56139

　　3. J. P. Bruin, M. Kostrzewa et al. Identification of Haemophilus influenzae and Haemophilus haemolyticus by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2014, 33:279–284

　　4. https://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm605336.htm

　　5. FDA首次批準質譜方法鑒定新型致病菌耳念珠菌 (Candida auris)

　　6. “布”下天羅地網，防止“耳念”侵襲