噬菌體展示技術研究RNA結合蛋白實驗（一）

實驗方法原理 噬菌體展示技術是將外源基因與噬菌體的表面蛋白基因融合，在融合了外源基因的噬菌體顆粒的表面就會表達相應的外源蛋白，即外源基因編碼的蛋白被展示在噬菌體顆粒的表面。

實驗材料 載體tRNA抗體寡核苷酸

試劑、試劑盒 抗生素儲存液BCIP葡萄糖儲存液X-Gal磁珠洗液蛋白酶抑制劑RNase 抑制劑TENT 結合緩沖液印跡緩沖液牛血清白蛋白考馬斯亮藍染液丙烯酰胺凝膠配制緩沖液電泳緩沖液乙酸鈉

儀器、耗材 頂層瓊脂LBYT順磁珠和磁架干膠裝置及玻璃紙核酸電泳裝置體外轉錄試劑盒

實驗步驟

一、材料與設備

所有操作中使用的均為蒸餾過的去離子水。

1. 載體：pDISPLAYblue B；宿主菌：DH12S（Gibco BRL 公司）；輔助噬菌體：M13K07（Gibco-BRL 公司）。

2. 抗生素儲存液（1000X）：氨芐青霉素（100 mg/ml，水溶液）；卡那霉素（70 mg/ml，水溶液）；甲氧苯青霉素（200 mg/ml，水溶液）。過濾除菌后分裝，-20℃ 保存。

3. 培養液/基：

LB：10 g 蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g NaCl，加水定容至 1 L，鋪板時加 15 g 瓊脂粉，高壓滅菌。

頂層瓊脂：每升 LB 培養液中加 7 g 瓊脂粉，高壓滅菌。

2X YT：16 g 蛋白胨，10 g 酵母提取物，5 g NaCl，加水定容至 1 L，高壓滅菌。

4. 培養液添加試劑：

BCIP：5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，Sigma 公司），用二甲基甲酰胺溶解，配成 40 mg/ml 儲存液，-20°C 保存。

葡萄糖儲存液：20% (m/V) 葡萄糖水溶液，過濾除菌。

X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopy-ranoside），用二甲基甲酰胺溶解，配成 40 mg/ml 儲存液，-20°C 保存。

5. 磁珠洗液 1：0.1 mol/L NaOH，0.1 mol/L NaCl。

磁珠洗液 2：0.1 mol/L NaCl。

6. 順磁珠和磁架：Dynabeads M-280 鏈親和素磁珠（Dynal 公司）。

7. PEG/乙酸銨：20% PEG8000，3.5 mol/L 乙酸銨。

8. 蛋白酶抑制劑：

苯甲基磺酰氟（PMSF）：100 mmol/L（乙醇溶解）儲存液，-20℃ 保存，工作濃度為 500 μmol/L。

抑胃酶肽（pepstatin）：1 mg/ml（甲醇溶解）儲存液，4℃ 保存，工作濃度為 0.7 μg/ml。

亮抑蛋白酶肽（Lcupeptin）：1 mg/ml（水溶解）儲存液，-20℃ 保存，工作濃度為 0.5 μg/ml。

9. RNase 抑制劑（RNasin，Promega 公司）。

10. TE：10 mmol/L Tris-HCI（pH 8.0），1 mmol/L EDTA，高壓滅菌。

11. TENT 結合緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA，250 mmol/L NaCl，0.5%（V/V）Triton X-100。

12. tRNA：E.coli tRNA，20 mg/ml 水溶液。

13. 抗體：

一抗：抗 MYC 標簽杭體；抗組氨酸抗體（Qiagen 公司）。

二抗：堿性磷酸酶標記的羊抗鼠 IgG。

14. 10X 印跡緩沖液：250 mmol/L Tris 堿，1.9 mol/L 甘氨酸，1% SDS。使用時，100 ml 10X 印跡緩沖液加 700 ml 水，加 200 ml 甲醇配成 1 L 印跡緩沖液。

15. 牛血清白蛋白：組分 V（Amersham 公司）。

16. 考馬斯亮藍染液：0.2%（m/V）考馬斯亮藍 R（Sigma 公司）溶解于 45% 甲醇，9% 乙酸的水溶液中。

17. 干膠裝置及玻璃紙：蛋白電泳及電轉移裝置；蛋白電泳分子質量 marker（Bio-Rad 公司）；硝酸纖維素膜。

18. 丙烯酰胺凝膠配制緩沖液：

2 mol/L Tris-HCl ( pH 8.8 )，1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8），10% SDS。

30% 甲雙叉丙烯酰胺-丙烯酰胺溶液：甲雙叉丙烯酰胺與丙烯酰胺比例為 0.8：29.2。

10% 過硫酸銨水溶液 ( 新鮮制備），四甲基乙二胺（TEMED），水飽和的正丁醇。