在線樣品濃縮毛細管區帶電泳分析毛發中的苯丙胺類毒品

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　苯丙胺類興奮劑是近期濫用的毒品。在這類毒品中，苯丙胺、甲基苯丙胺、亞甲基二氧基苯丙胺(MDA)和亞甲基二氧基甲基苯丙胺(MDMA)濫用得更普遍[1]。苯丙胺類毒品的濫用引起的健康和社會問題已經引起了國際社會的廣泛關注，同時促進了用于監控濫用行為的各種分析方法的研究。

　　通過毛發監測毒品的濫用具有許多優勢，如樣品易于收集，并可在室溫下長期保存;最重要的是，它可以檢測出長達數月的毒品，被稱作長期毒品使用的記錄帶;而且毛發中的毒品濃度與毒品的攝入量具有關聯性。近幾年，許多研究者研究了長期吸毒者的毛發樣品。研究的毒品種類有鴉片、卡可因、大麻、苯丙胺類等等[2～8]。到目前為止，氣相色譜質譜法仍然是毛發分析使用最多的一種方法[1，5，9]。該方法靈敏度高、選擇性好，質譜的鑒定能力強。在多數情況下，這種方法可以檢測到濃度為0.5～1.0 μg/g的毛發，滿足長期使用者的監測靈敏度。由于毛細管電泳(CE)分離效率高，且易于操作，運行成本低廉，已經成功地用于繳獲毒品和生物檢材中的毒品分析[10]。但是將CE用于毛發分析仍然受到很多限制。特別是當采用UV在線檢測時，由于毛細管本身光程的限制和進樣量的限制，使得檢測的靈敏度很低。而在毛發中毒品和毒品代謝物的濃度一般很低(一般為1 μg/g毛發)。根據文獻報道，采用區帶毛細管電泳CZE)或膠束電動毛細管色譜(MECC)，最低檢測濃度約為1 mg/L，顯然這一靈敏度不能滿足毛發中的毒品分析。

　　文獻報道，通過在線濃縮技術提高CZE或膠束電動毛細管色譜(MECC)的檢測靈敏度，例如場放大樣品堆積技術(fieldamplified sample stacking, FASS)[11～13]。這一方法依據樣品溶液與緩沖液的電導率不一致實現樣品的在線富集。分析前毛細管首先用高電導的緩沖液沖洗并充滿毛細管;之后進入一小段水柱，然后以電遷移方式進入低電導的樣品溶液。樣品溶液的電導率低于緩沖液的電導率，則在毛細管中的樣品段形成高的電場，使被分析的組分在樣品溶液中和水柱中的遷移速率高于在緩沖液中的速率。因此，在水柱與緩沖液的交界處形成一個狹窄的濃縮的組分帶。可顯著提高檢測的靈敏度。本研究建立了在線場放大樣品堆積(FASS)的CZE電泳技術，對苯丙胺、甲基苯丙胺、MDA、MDMA 4種毒品進行了分離和定量測定，檢測的靈敏度提高了1000倍，對于標準品的檢出限可達到0.06 μg/L。用本方法對添加毒品的毛發進行提取和測定，可檢測到添加濃度1 μg/g的毛發。因此，本方法可用于該類濫用毒品的毛發分析。

　　2 實驗部分

　　2.1 儀器、試劑與樣品

　　毛細管電泳分析在貝克曼庫爾特公司生產的配有二級管陣列檢測器的毛細管電泳儀(P/ACE MDQ)中完成。使用的毛細管為未涂層的熔融硅膠毛細管(polymicro technologies, phoenix, AZ)：總長50.2 cm,有效柱長40 cm, 柱內徑73 μm 。分析中毛細管溫度為20℃;定量檢測波長為200 nm。苯丙胺(Am)、甲基苯丙胺(MAm)、3，4亞甲基二氧基苯丙胺(MDA)和3，4亞甲基二氧基甲基苯丙胺(MDMA)等購于 Cerilliant (Round Rock,TX);毛細管電泳分析內標，苯乙胺(Fisher公司);實驗中使用的NaH2PO4、甲醇、NaOH、HCl、H3PO4均為分析純試劑。

　　2.2 毛細管預處理

　　毛細管在使用前分別用1 mol/L NaOH (30 min)、 蒸餾水(30 min)、緩沖液(30 min)在174 kPa壓力下沖洗;兩次分析之間，用0.1 mol/L NaOH (2 min)、蒸餾水(1 min)、緩沖液(3 min)沖洗;分析結束前，用1 mol/L NaOH (1 min)、蒸餾水(5 min)沖洗，最后空氣干燥3 min。

　　2.3 在線濃縮毛細管區帶電泳(CZE)分析過程

　　分析用二元緩沖液由含體積40%乙烯乙二醇和100 mmol/L磷酸鹽水溶液組成，用4 mol/L H3PO4調整至pH 2.5(pH計，貝克曼公司)，使用前用0.45 μm過濾膜過濾(日本Millex公司);樣品溶液由含80%異丙醇的0.1 mmol/L H3PO4溶液制備。

　　兩次分析之間采用反向沖洗，即在檢測器端施加139 kPa壓力，依次用0.1 mol/L NaOH(2 min)，水(1 min)、緩沖液(3 min)沖洗。沖洗后，首先將毛細管兩端至于蒸餾水中，等待6 s,然后在進口端施加3.5 KPa壓力，壓入水柱3 s;之后將毛細管進口端置于樣品池中，10 kV 下進樣99 s;最后在進樣端施加20 kV電壓正向分離。

　　3 結果與討論

　　3.1 FASSCZE與常規CZE分析結果比較

　　圖1為濃度5 μg/L的標準品與內標混合物經過FASS后，再經CZE分離得到的電泳譜圖。圖2為濃度10 mg/L的標準品與內標混合物用常規CZE分離得到的電泳譜圖。兩圖比較可看出，經過FASS后，靈敏度明顯提高。但在富集后的譜圖中(圖1)存在未知峰，可能是由于試劑中的雜質經富集后形成的。

　　圖1 4種苯丙胺毒品標準品與內標混合物的FASSCZE分離譜圖(略)

　　Fig.1 Electropherogram of the mixture of 4 amine drugs

　　IS. 苯乙胺(benzylamine);1. 苯丙胺(amphetamine);2. 甲基苯丙胺(methamphetamine);3. 3,4methylenedioxyrmphetamine (MDA);4. 3,4methylene methamphetamine (MDMA);C: 5 μg/L。

　　圖2 4種毒品與內標混合物的CZE電泳分離譜圖(略)

　　Fig.2 Electropherogram of 4 amine drugs with conventional capillary zone electrophoresis (CZE)

　　峰標注同圖1(濃度均為10 mg/L)。緩沖液為100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 2.5)，電遷移進樣(10 kV,8 s)，分析電壓20 kV(100 mmol/L phosphate buffer (pH 2.5) was used with sample electrokinetic injection at 10 kV for 8 s)。peak number as Fig.1; C: 10 mg/L。

　　3.2 水柱對在線濃縮的影響

　　本實驗中，在樣品和緩沖液間引入了一水柱。水柱的電導低于緩沖液，樣品隨溶液進入后，由于樣品溶液和水柱的電阻大，形成高電場，樣品離子迅速遷移至水柱與緩沖液的界面，隨后遷移速率降低。因此，樣品在界面處富集。顯然水柱的長短將影響分離的效果和檢測的靈敏度。

　　本研究分別實驗了無水柱、在2.1 kPa下進水3 s和在3.5 kPa壓力下分別進水為3、6、9和12 s 時(對應的水柱長度分別約為2、3、6、9和12 mm，根據在相同壓力下水通過整個毛細管的時間計算得出)對分離和檢測靈敏度的影響。試驗結果表明，水柱長度在2 mm和3 mm時，峰響應較高，且峰形良好。水柱增大后，靈敏度改善不明顯且分離變差。無水柱的情況下，靈敏度較低，且重復性較差。

　　3.3 在線濃縮CZE分析定量參數

　　3.3.1 定量線性考察 用含內標苯乙胺5 μg/L的80%異丙醇的0.1 mmol/L H3PO4溶液配制4種苯丙胺毒品系列標準溶液0.05、0.1、0.5、1、5、10、15及20 μg/L,用建立的FASSCZE電泳條件進行分離測試，然后用毒品峰面積與內標峰面積的比值與毒品濃度作標準曲線。結果表明當毒品濃度較低時(低于5 μg/L)，響應與濃度間具有良好的線性關系。當樣品濃度增大后，響應出現平衡現象，線性關系變差。

　　在線性關系良好的濃度范圍0.05~5 μg/L內，建立標準曲線。當信噪比為3時，計算得出檢出限(表1)。

　　表1 線性方程與檢出限(略)

　　Table 1 Calibration equations and limits of detection (LOD)

　　Y: 毒品峰面積與內標峰面積比值(ratio of drug peak area to IS peak area);X： 毒品濃度(drug concentration): μg/L。

　　3.3.2 定量重復性考察 用標準品考察了濃度分別為0.1、1、5 μg/L的重復性，結果列于表2中。從表2可以看出，在濃度為5 μg/L時，分析的相對標準偏差在10%范圍左右;當濃度為1 μg/L以下時，定量的重復性變差。

　　表2 定量檢測的重復性(略)

　　Table 2 Reproducibility for quantitation

　　圖3 空白與添加毛發經堿性條件消解、環己烷提取后，用FASSCZE方法分析的電泳譜圖(略)

　　Fig.3 Electropherograms of the blank (a) and spiked hair (b) extracted with cyclohexane after alkali digestion

　　峰標注和電泳條件同圖1(peak identities as in Fig.1 and also the same CE conditions as Fig.1)。

　　3.4 添加毒品的毛發分析

　　在所建立的在線濃縮的CZE分析方法的基礎上，對添加毒品的毛發進行了提取測定。分析用毛發取自一無吸毒經歷的15歲健康男性少年。首先將毛發用5%水溶液的清潔劑清洗10 min去除毛發表面油脂，然后用流水沖凈清潔劑，在室溫下自然干燥。再將毛發剪成約1 mm小段，按照吸毒者毛發中的一般含量(0.4~5 μg/g)添加毒品模擬中毒毛發進行提取測定。將毛發樣品(約20 mg)加入0.75 mL 1 mol/L NaOH，于70℃水浴中消解30 min。將消解后的液體轉移至2 mL的離心塑料瓶中。因為溶液為堿性，可直接用有機溶劑提取。加入075 mL環己烷，在渦流振蕩器上振蕩提取1 min，然后在離心機中將兩相分離;用移液管將有機相轉移至另一小瓶中，在氮氣流下吹干溶劑，再用電泳分析用溶劑溶解，并用0.45 μm注射器濾膜過濾，然后用于CE分析。

　　圖3為20 mg 空白毛發添加20 ng 4種苯丙胺毒品和內標后(相當于1 μg/g)，用堿性條件消解后再用環己烷提取，然后用FASSCZE分離后得到的電泳譜圖。其中內標和苯丙胺、甲基苯丙胺的譜峰較小，加之其它雜質峰的共存，難于認定。推定原因一是苯丙胺和甲基苯丙胺的檢測靈敏度較MDA和MDMA低，二是這兩種毒品和內標的分子較小，在消解和提取揮發過程的損失較大，使毛發中的檢出限減小。添加的毛發中MDA、MDMA顯示了較高的靈敏度。

　　致謝 對加拿大哥倫比亞大學David Chen 教授對本研究的支持與幫助表示衷心地感謝。

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