基因組編輯調控植物內源基因翻譯效率的實驗流程

上游開放閱讀框uORF廣泛存在于動植物基因的5’非翻譯區，通常能夠抑制下游主開放閱讀框pORF的翻譯。中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組率先利用CRISPR/Cas9技術對uORF進行編輯，發現能夠顯著提高目標基因的翻譯效率，建立了利用基因組編輯調控內源基因蛋白質翻譯效率的新方法，相關成果于2018年發表在Nature Biotechnology；該方法可以培育出不含轉基因成分的基因過表達植物，為作物育種及功能基因研究提供了十分重要的技術手段。由于uORF在動植物基因組中普遍存在，編輯uORF提高內源蛋白水平將有廣泛的應用。為了進一步普及和促進該方法的使用，高彩霞研究組日前在Nature Protocols發表文章，詳細介紹對植物基因的uORF進行編輯提高目標基因翻譯效率的具體實驗流程。

真核細胞的mRNA由5’非翻譯區（5’ Untranslated Region， 5’UTR）、編碼蛋白的開放閱讀框區（Open Reading Frame）及3’端非翻譯區（3’ Untranslated Region， 3’UTR）構成。上游開放閱讀框（uORF， Upstream Open Reading Frame）是位于cDNA 5’前導序列（5’ Leader Sequence）的一類元件，在動植物中廣泛存在，可以參與基因翻譯水平的調控，在很多情況下對基因主開放閱讀框（pORF， Primary Open Reading Frame）的翻譯具有抑制作用。本技術論文在此基礎上詳細介紹了如何利用基因組編輯技術修飾基因的uORF，實現調控目的基因的表達。整個流程包括：植物內源基因uORF的預測；雙熒光素酶報告系統驗證；預測的uORF對目的基因翻譯水平的影響；設計并構建sgRNA對uORF進行編輯；瞬時實驗中驗證基因組編輯技術突變的uorfs序列對下游目的基因表達的影響；篩選transgene-free的純合uorf突變體植株并分析脫靶效應；在mRNA、蛋白和表型水平對野生型、uorf突變體植株中的目的基因表達量測定等具體方法和實驗細節。其中預測并在瞬時實驗中確定uORF的功能需要2-3周時間。4個月左右可以獲得目的基因表達水平不同程度增強的uorf突變體。

該文章于2020年1月8日在線發表于Nature Protocols雜志上（DOI：10.1038/s41596-019-0238-3）。