基因組DNA的提取與檢測

　　基因組DNA的提取通常用于構建基因組文庫、Southern雜交(包括RFLP)及PCR分離基因等。利用基因組DNA較長的特性,可以將其與細胞器或質粒等小分子DNA分離。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團飄浮其中, 可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部, 從而達到提取的目的。在提取過程中,染色體會發生機械斷裂,產生大小不同的片段,因此分離基因組DNA時應盡量在溫和的條件下操作,如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過程要輕緩, 以保證得到較長的DNA。一般來說,構建基因組文庫, 初始DNA長度必須在100kb以上,否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。而進行RFLP和PCR分析, DNA長度可短至50kb, 在該長度以上,可保證酶切后產生RFLP片段(20kb以下),并可保證包含PCR所擴增的片段(一般2kb以下)。

　　不同生物(植物、動物、微生物)的基因組DNA的提取方法有所不同; 不同種類或同一種類的不同組織因其細胞結構及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時必須參照文獻和經驗建立相應的提取方法, 以獲得可用的DNA大分子。尤其是組織中的多糖和酶類物質對隨后的酶切、PCR反應等有較強的抑制作用,因此用富含這類物質的材料提取基因組DNA時, 應考慮除去多糖和酚類物質。

　　本實驗以水稻幼苗(禾本科)、李(蘋果)葉子、動物肌肉組織和大腸桿菌培養物為材料,學習基因組DNA提取的一般方法。

　　從植物組織提取基因組DNA

　　一、材料

　　水稻幼苗或其它禾本科植物，李(蘋果)幼嫩葉子。

　　二、設備

　　移液器，冷凍高速離心機，臺式高速離心機，水浴鍋，陶瓷研缽，50ml離心管(有蓋)及5ml和1.5ml離心管，彎成鉤狀的小玻棒。

　　三、試劑

　　1、提取緩沖液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。

　　2、提取緩沖液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸鈉，6.0gPVP，240ul巰基乙醇，加水至300ml。

　　3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇

　　4、 RnaseA母液：配方見第一章。

　　5、其它試劑：液氮、異丙醇、TE緩沖液，無水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。

　　四、操作步驟：

　　(一)水稻幼苗或其它禾木科植物基因組DNA提取

　　1. 在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液Ⅰ, 60℃水浴預熱。

　　2. 水稻幼苗或葉子5-10g, 剪碎, 在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預熱的離心管中, 劇烈搖動混勻, 60℃水浴保溫30-60分鐘(時間長,DNA產量高), 不時搖動。

　　3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 顛倒混勻(需帶手套, 防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10分鐘, 使水相和有機相分層(必要時可重新混勻)。

　　4. 室溫下5000rpm離心5分鐘。

　　5. 仔細移取上清液至另一50ml離心管,加入1倍體積異丙醇,混勻,室溫下放置片刻即出現絮狀DNA沉淀。

　　6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA絮團,在干凈吸水紙上吸干,轉入含TE的離心管中,DNA很快溶解于TE。

　　7. 如DNA不形成絮狀沉淀,則可用5000rpm離心5分鐘, 再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀,往往難溶解于TE,可在60℃水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。

　　8. 將DNA溶液3000rpm離心5分鐘, 上清液倒入干凈的5ml離心管。

　　9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分鐘, 除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟)。

　　10. 加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇,混勻,-20℃放置20分鐘左右,DNA形成絮狀沉淀。

　　11. 用玻棒撈出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干凈吸水紙上吸干。

　　12. 將DNA重溶解于1ml TE, -20貯存。

　　13. 取2μl DNA樣品在0.7% Agarose膠上電泳, 檢測DNA的分子大小。同時取15μl稀釋20倍, 測定OD260/OD280, 檢測DNA含量及質量。

　　[注意] 5g樣品可保證獲得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。

　　(二). 從李(蘋果)葉子提取基因組DNA

　　1. 取3-5克嫩葉, 液氮磨成粉狀。

　　2. 加入提取緩沖液Ⅱ10ml, 再研磨至溶漿狀。10000rpm, 10min。

　　3. 去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混勻。65℃, 30-60min, 常搖動。

　　4. 同本節(一)中步驟3-13操作。

　　從動物組織提取基因組DNA

　　一、材料

　　哺乳動物新鮮組織。

　　二、設備

　　移液管、高速冷凍離心機、臺式離心機、水浴鍋。

　　三、試劑

　　1、分離緩沖液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。

　　2、其它試劑：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉劑)，乙醚，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，無水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。 四、操作步驟:

　　1. 切取組織5g左右,剔除結締組織,吸水紙吸干血液,剪碎放入研缽(越細越好)。

　　2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分離緩沖液。

　　3. 加1ml 10% SDS, 混勻,此時樣品變得很粘稠。

　　4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37℃保溫1-2小時, 直到組織完全解體。

　　5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混勻,5000rpm離心數秒鐘。

　　6.取上清液于新離心管，用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提。待分層后,3000rpm離心 5分鐘。

　　7. 取上層水相至干凈離心管, 加2倍體積乙醚抽提(在通風情況下操作)。

　　8. 移去上層乙醚,保留下層水相。

　　9. 加1/10 體積3mol/L NaAc, 及2倍體積無水乙醇顛倒混合沉淀DNA。室溫下靜止10-20分鐘，DNA沉淀形成白色絮狀物。

　　10. 用玻棒鉤出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水紙上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。

　　11. 如果DNA溶液中有不溶解顆粒,可在5000rpm短暫離心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保溫30分鐘, 用酚抽提后, 按步驟9-10重沉淀DNA。

　　細菌基因組DNA的制備

　　一、材料

　　細菌培養物。

　　二、設備

　　移液管, 高速冷凍離心機, 臺式離心機，水浴鍋。

　　三、試劑

　　1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2O,緩慢加入10g CTAB,加水至100ml。

　　2、其它試劑：氯仿:異戊醇(24:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，異丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉劑)，5mol/L NaCl。

　　四、操作步驟：

　　1. 100ml 細菌過夜培養液, 5000rpm離心10分鐘, 去上清液。

　　2. 加9.5ml TE懸浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混勻, 37℃保溫1小時。

　　3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混勻。

　　4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混勻, 65℃保溫20分鐘。

　　5. 用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm離心10分鐘, 將上清液移至干凈離心管。

　　6. 用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干凈管中。

　　7. 加1倍體積異丙醇, 顛倒混合, 室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。

　　8. 用玻棒撈出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA沉淀無法撈出,可5000rpm離心, 使DNA沉淀。

　　9. 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三節中操作步驟處理。

　　基因組DNA的檢測

　　上述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA產量及質量均不同,有時DNA中含有酚類和多糖類物質,會影響酶切和PCR的效果。所以獲得基因組DNA后,均需檢測DNA的產量和質量。

　　1. DNA溶液稀釋20-30倍后,測定OD260 /OD280 比值, 明確DNA的含量和質量。

　　2. 取2-5μl 在0.7% agarose膠上電泳, 檢測DNA的分子大小。

　　3. 取2μg DNA, 用10單位(U)HindⅢ酶切過夜, 0.7% agarose膠上電泳, 檢測能否完全酶解(做RFLP, DNA必須完全酶解)。

　　如果DNA中所含雜質多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多, 影響接續的分析和操作,可以用下列方法處理：

　　(1)選用幼嫩植物組織，可減少淀粉類的含量。

　　(2) 酚:氯仿抽提, 去除蛋白質和多糖。

　　(3)Sepharose柱過濾, 去除酚類、多糖和小分子DNA。

　　(4)CsCl梯度離心, 去除雜質, 分離大片段DNA(可用作文庫構建)。

 

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