基因編輯那么熱，可是你都會用了嗎？

　　基因編輯是一種遺傳工程技術，針對某個序列已知但功能未知的序列，通過改變生物的遺傳基因，使其特定的基因功能喪失作用，通過研究對生物體造成的影響，進而推測出該基因的生物學功能。本文為你科普基因編輯三大技術：

　　基因敲除

　　進行DNA水平編輯。一般用于構建基因敲除鼠模型。

　　CRISPR/Cas9：CRISPR/Cas9系統作為細菌和古細菌的獲得性免疫系統，通過RNA介導特異性的切割外源遺傳物質，用以對抗入侵的病毒和質粒。使用Cas9切口酶和一對sgRNA，兩個相近的切口造成DNA雙鏈斷裂，誘導細胞發生非同源末端連接修復，造成目的基因的突變。

　　CRISPR/Cas9技術自問世以來，取代“鋅指核酸內切酶（ZFN）”、“類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN），成為科研、醫療等領域的有效工具”.一般通過體外轉錄得到sgRNA與cas9的mRNA，通過注射到原核期受精卵內，移植到假孕母鼠體內獲得基因編輯的小鼠進行基因功能研究。

　　構建方法：

　　確定待敲除基因的靶位點。

　　設計識別靶位點的識別的一對sgRNA。

　　構建可表達sgRNA的Cas9質粒。

　　體外轉錄sgRNA 和Cas9 RNA。

　　將sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵檢測sgRNA活性。

　　將有活性的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵建立Founder。

　　將Founder自交得到F1代。

　　適用范圍：

　　制備敲除鼠，利用敲除鼠進行基因功能的研究；進行細胞水平敲除基因時，可以選擇慢病毒載體，構建lenticrispr-v2質粒，通過包裝病毒進行細胞水平敲除。

　　基因敲減

　　RNA水平，是指通過降解具有同源序列靶基因的mRNA，達到阻止基因表達的作用。一般用于細胞水平敲減基因。

　　（1）RNA干擾：

　　是siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物RISC。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默，是一種特異性的轉錄后基因沉默。

　　一般合成針對靶基因的siRNA，通過轉染的方法使之進入細胞內，使靶基因沉默。這一方法受轉染效率的影響較大。目前有不少基因的siRNA已經有商業產品，所以使用時買來就可以了，比較方便。

　　適用范圍：

　　一般通過公司合成后，通過轉染細胞進行細胞水平敲減。

　　（2）shRNA：

　　“短發夾RNA”，shRNA包括兩個短反向重復序列，中間由一莖環（loop）序列分隔的，組成發夾結構，由polⅢ啟動子控制。隨后再連上5-6個T作為RNA聚合酶Ⅲ的轉錄終止子。

　　構建shRNA的病毒表達載體，常用的病毒載體有腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體等，機制與質粒載體相似，利用了病毒感染細胞效率比較高的特點，解決了用質粒載體轉染效率低的缺陷。

　　構建方法：

　　shRNA設計：設計RNA干擾序列是RNAi實驗的關鍵。

　　載體構建：可根據實驗需求選擇慢病毒、腺病毒載體。

　　轉染細胞：常用的方法包括磷酸鈣轉染、脂質體轉染、電穿孔轉染等

　　觀測GFP 熒光和穩定表達細胞系篩選：可用于帶有GFP標簽的質粒載體。

　　檢測RNA 干擾效率：可以在蛋白水平或mRNA水平檢測RNA干擾效率。

　　適用范圍：

　　一般通過構建慢病毒、腺病毒等進行細胞水平敲減。