多肽的固相合成、切割及純化（一）

固相肽合成（solid phase peptide synthesis, SPPS）技術是現代蛋白質化學的一項關鍵技術，也是對現代分子生物學和基因工程研究具有重大影響和重要意義的技術。它的基本過程為：1、偶聯保護氨基，即將第一個保護氨基以共價鍵偶聯外固相載體上（在合成過程中始終不能脫落）。2、脫保護，在側鍵基團保持穩定條件下脫去氨基上的保護，暴露出自由氨基，例如脫去Fmoc。3、偶聯，將下一個已活化的氨基酸與結合于固相的前一個氨基酸縮合形成肽鍵。4、肽鍵延長，反復進行脫保護與偶聯兩步使肽鍵延長到設計長度。5、切割，將合成的肽由固相載體上切割下來并脫去側鏈保護。6、純化，切割后的肽進行純化、鑒定。下面以合成的huBPP為例，簡介在Pioneer上的合成切割及純化過程：

一、huBPP的合成

（一）儀器及試劑

Pioneer肽合成儀、氬氣，純度99.99%、二甲基甲酰胺（DMF）、哌啶、HATU、二異丙基乙胺、 甲醇、TFA（三氟乙酸）、合成需要的側鍵保護氨基酸、樹脂 Fmoc-PAL-PEG-PS

注：Fmoc-芴甲氧羰基（Fluoreny lmethyl oxoxy carbonyl）

PEG-聚乙二醇

PAL-肽酰胺接頭（peptide amide linker）

PS-樹脂（polystyrene）

（二）合成原理

（三）合成過程

準備氣體→沖洗管路→檢查管路→合成準備（裝試劑、輸入序列等）→合成→合成結束

（四）操作程序

1．開機及調節氣壓、檢查是否漏氣

1）依次打開電源開關、UPS開關、計算機

2）安裝所有的瓶子（空）

3）檢查氦氣罐內氣體量（保證剩余量>200PSI），輸出壓力為20PSI

4）打開合成儀電源，等待儀器進入主菜單

5）按Tools-Ding-I/O1

6）打開氣體閥Gas Valve(4) ON回主菜單

7）按Manul-Fluidie System 1 -Wash

8）調節壓力到6±0.2PSI，回主菜單

9）按Tools-Diag-Leak-Start，回主菜單
 

2．沖洗系統管道

1）按Tools-Bottle

2）在Wash瓶內裝入2L DMF

3）主菜單中按Prime-Prime Individual，回主菜單

4）按Prime-More-Start up/Shut Down-Column 1

5）對Column2重復上一步操作

6）回主菜單
 

3．檢查每個瓶子的管道

1）按Tools-Bottle

2）在所有瓶內裝入50mL DMF，回主菜單

3）按Prime-Prime Lines-Column1-OK，回主菜單

4）按Manual-Fluidic System1(2或Both，視情況而定) -Wash-Fluid  Destination至Wast出現-YES

5）打開Wash瓶，抽出管道-Start，檢查兩個管道是否通暢-Cancel

6）重復以上各步，分別檢查各個管道是否通暢。回主菜單

7）對Column2同樣操作，回主菜單
 

4．合成準備

1）按Tools-Bottle

2）卸下各個瓶子，裝入用于合成的試劑，回主菜單

3）按Manu1-Transport System1(2或Both) -End

4）在第1至n位中放入氨基酸（放置順序與合成序列相反），第n+2位放一個空管

5）在Transport System視窗中循環按Adv-Align檢查每個位置是否有氨基酸管同時觀察探針運動是否正常

6）按Prime-2-System Prep-Column 1-OK，cancel

7）不要接柱子，對Column2同樣操作

8）裝柱并上柱

9）Prime4-Column Prep-Column 1-OK, 對Column2同樣操作

10）按Tools-Config-Def-OK，回主菜單

11）按Seq-Edit-Ins輸入要合成的序列

12）Seq Menu-Run-Column 1(2或Both) 必要修改參數-OK

13）注：序列輸入以及參數的設置也可以在計算機上進行。
合成

從主菜單按Strt1、Strt2，開始合成，直到結束。