大腸桿菌感受態細胞的幾種制備方法

  常態的細胞不能攝入外部溶液中的 DNA，，所以要轉化質粒 DNA 進入大腸桿菌必須首先 
制備感受態的大腸桿菌細胞。受體細胞經過一些特殊方法（如：CaCl，RuCl 等化學試劑法） 
的處理后，細胞膜的通透性發生變化，成為能容許多有外源 DNA 的載體分子通過的感受態細 
胞(competent cell) 。  
    轉化，是將異源 DNA 分子引入一細胞株系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段， 
是基因工程等研究領域的基本實驗技術。 進入細胞的 DNA分子通過復制表達，才能實現遺 
傳信息的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀。轉化過程所用的受體細胞一般是限制－修飾 
系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株。  
   α-互補現象：因為許多載體都帶有一個 LacZ 基因的調控序列和頭 146 個氨基酸的編碼 
信息，編碼 α-互補肽，該肽段能與宿主編碼的缺陷型 β-半乳糖苷酶實現基因內互補（ α- 
互補）。當這種載體轉入可編碼?－半乳糖苷酶 C端部分序列的宿主細胞中時，在異丙基-?-D 
硫代半乳糖苷（IPTG）的誘導下，宿主可同時合成這兩種肽段，雖然它們各自都沒有酶活性， 
但它們可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質。所以稱這種現象為 α-互補現象。由互補產 
生的 α－半乳糖苷酶(LacZ)能夠作用于生色底物 5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖 
苷(X-gal)而產生藍色的菌落，所以利用這個特點，在載體的該基因編碼序列之間人工放入 
一個多克隆位點，當插入一個外源 DNA 段時，會造成 LacZ(α)基因的失活，破壞 α-互補 
作用，就不能產生具有活性的酶。所以，有重組質粒的菌落為白色，而沒有重組質粒的菌落 
為藍色。  
大腸桿菌感受態細胞的幾種制備方法                     
方法一：   
    細菌轉化的方法多以Mendel和Higa（1970）的發現為基礎，其基本方法是用冰預冷的 
CaCl 或多種 2 價陽離子等處理細菌，使之進入感受態得以轉化。  
    2 

    用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞，常用于成批制備感受態細菌。本法適 
用于大多數大腸桿菌菌株，且迅速、重復性好。操作過程簡述如下。  
    1．從 37℃培養 16～20h 的新鮮平板中挑取一個單菌落（如大腸桿菌 DH52），或 1ml 
新鮮的 16～20h 過夜培養物，轉到一個含有 100mlLB 培養基的1L或 500ml燒瓶中。于 37℃ 
劇烈振搖培養約 2～3h（旋轉搖床 200～300r/min），每隔 20～30min 測量 OD600 值≈0.4。  
    2．在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的 50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置 
10～20min。  
    3．于 4℃用 SorvallGS2 轉頭（或與其離心管相配的轉頭）以 4000r/min 離心 10min， 
以回收細胞。  
    4．倒數培養液，將管倒置 1min以使zui后殘留的痕量培養液流盡。  
    5．以 10ml用冰預冷的 0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上。  
    6．于 4℃用 SorvallGS3 轉頭（或與其相應的轉頭）以 4000r/min 離心10min，以回收 
細胞。  
    7．倒出培養液，將管倒置 1min以使zui后殘留的痕量培養液流盡。  
    8．每 50ml初始培養物用 2ml冰預冷的 0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細 
胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存備用。  
    9．用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取 200μl 轉移到無菌的微量離心管 
中，每管加 DNA 或連接反應混合物（體積≤10μl，DNA≤50ng），輕輕旋轉以混勻內容物， 
在冰中放置 30min。