天津工生所在新一代堿基編輯技術開發方面取得新進展

　　堿基編輯（base editing，BE）作為前沿的基因組編輯技術，能夠在基因組水平上實現精確、高效的單堿基編輯。該技術廣泛應用于基礎研究、基因治療和細胞工廠構建等領域。常用的DNA堿基編輯器主要是通過將可編程的DNA結合蛋白（如Cas9）與堿基脫氨酶融合實現的，包括胞嘧啶堿基編輯器（CBE）、腺嘌呤堿基編輯器（ABE）以及糖基化酶堿基編輯器（GBE）等，可以實現C-to-T、A-to-G以及C-to-G等種類的堿基編輯。然而，這些堿基編輯器是針對C和A堿基的直接編輯，且所包含的脫氨酶可能導致非Cas9依賴的DNA或RNA脫靶。

　　中國科學院天津工業生物技術研究所研究員畢昌昊帶領的合成生物技術研究團隊，聯合研究員張學禮帶領的微生物代謝工程研究團隊，開發了不依賴脫氨酶（deaminase-free，DAF）的堿基編輯器DAF-CBE和DAF-TBE，分別在大腸桿菌中實現C-to-A、T-to-A的堿基顛換，在哺乳動物細胞中實現C-to-G、T-to-G的堿基顛換編輯。

　　該研究通過定向進化改造了人源尿嘧啶糖基化酶（UNG）的兩個突變體UNG（N204D）和UNG （Y147A），獲得了兩種高活性的DNA糖基化酶，分別可以作用于胞嘧啶堿基的CDG4和胸腺嘧啶堿基的TDG3。進而，研究將這兩種DNA糖基化酶與nCas9（Cas9、D10A）融合，構建了CDG4-nCas9和TDG3-nCas9兩種堿基編輯器，用于在大腸桿菌中進行C-to-A和T-to-A的編輯。實驗結果顯示，CDG4-nCas9和TDG3-nCas9在大腸桿菌中的編輯效率最高分別達到58.7％和54.3％。進一步，研究針對Homo sapiens密碼子優化版本的CDG4-nCas9和TDG3-nCas9，在HEK293T細胞中實現了C-to-G和T-to-G的顛換編輯，編輯效率分別達到38.8%和48.7%。這兩種編輯器的脫靶效果低于常用的胞嘧啶堿基編輯器（BE4max）和糖基化酶堿基編輯器（CGBEs）。因此，研究將這兩個編輯器命名為DAF-CBE和DAF-TBE。此外，通過進一步的工程改造，該團隊優化了CDG和TDG的空間位置，得到了DAF-CBE2和DAF-TBE2的新版本。它們的編輯窗口從原來的間隔序列（protospacer sequence）5'端移動到中間區域，且C-to-G和T-to-G的編輯效率分別提高了3.5倍和1.2倍。DAF-CBE和DAF-TBE實現了人誘導多功能干細胞（hiPSC）高效編輯。

　　綜上所述，經過定向進化改造，該團隊開發的DAF-CBEs和DAF-TBEs堿基編輯器在大腸桿菌和哺乳動物細胞中實現了高效的堿基顛換編輯，無需使用脫氨酶。與現有的引導編輯器（prime editing）或糖基化酶堿基編輯器（GBEs）相比，DAF-BEs具有相當的編輯效率、更小的尺寸和更低的脫靶率，這擴展了堿基編輯器的編輯類型，為工業菌株鑄造和生物醫藥等領域的相關研究提供了新的技術工具。

　　近日，相關研究成果發表在《自然-生物技術》（Nature Biotechnology）上。研究工作得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金、天津市合成生物技術創新能力提升行動專項、中國科學院青年創新促進會和天津市自然科學基金的支持。