如何作QPCR的標準曲線

作QPCR的
標準曲線
可以用PCR－
ELISA法
作。
具體如下：
PCR－ELISA法：
利用
地高辛
或
生物素
等標記
引物
，擴增產物被固相板上特異的探針所結合；
再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－
辣根過氧化物酶
結合物，最終酶使底物顯色。
常規的PCR－ELISA法只是
定性實驗
，加入
內標
，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。
通過測定一系列已知組分的標準物質的某理化性質，從而得到該性質的數值所組成的曲線。
擴展資料：
實時熒光
定量PCR
技術，在
PCR反應體系
中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
檢測方法：
1、SYBRGreenⅠ法：
在PCR反應體系中，加入過量SYBR
熒光染料
，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號。
而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
SYBR定量
PCR擴增
熒光
曲線圖
、PCR產物
熔解
曲線圖（單一峰圖表明PCR擴增產物的
單一性
）。
2、
TaqMan探針
法：
探針完整時，報告基團發射的熒光信號被
淬滅
基團吸收；
PCR擴增時，Taq酶的5’-3’
外切酶
活性將探針
酶切
降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號。
即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。
PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省（默認）設置是3-15個循環的熒光信號的
標準偏差
的10倍，即：
threshold
=
10*SDcycle
3-15。
利用已知起始
拷貝數
的
標準品
可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，
縱坐標
代
Ct值
。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
參考資料：