如何揭開長非編碼RNA的神秘面紗

　　長非編碼RNA(lncRNA)長達兩百個核苷酸以上的轉錄本，但并不編碼任何蛋白質。盡管如此，長非編碼RNA在不同組織和發育階段的表達依然具有特異性，說明lncRNA的調控具有重要的生物學意義。細胞中絕大多數lncRNA(也稱lincRNA)位于細胞核，它們對應的DNA區域有的與蛋白編碼基因重疊，有的位于基因間或者內含子中。

　　為何細胞不惜耗費能量對這些非編碼RNA的表達和定位進行嚴格調控呢?這些RNA分子究竟有何功能?RNA測序技術的發展使人們得以初窺這一神秘的分子，現在lncRNA的許多相關信息都可以在新數據庫中查到，例如Broad研究所、哈佛大學和麻省理工共同開發的Human Body Map lincRNAs catalog。不過現在人們了解到的lncRNA只是冰山一角，還有大量lncRNA的功能有待科學家們去探尋。

　　lncRNA研究工具

　　現在lncRNA研究面臨的一個主要挑戰是，研究工具還在不斷開發和改進中，其中包括設計帶有不同lncRNA檢測探針的芯片。安捷倫公司的 SurePrint G3 Gene Expression v2 microarray就是其中之一，該芯片的探針設計不僅參照主要公共數據庫中的mRNA，還參照了Broad研究所開發的lincRNA和 TUCP(transcripts of uncertain coding potential)數據庫，可以同時檢測編碼RNA和非編碼RNA。據安捷倫公司基因表達產品經理Corinna Nunn介紹，lncRNA的表達水平比編碼RNA低，“因此芯片的動態范圍寬很重要，這樣才能夠保證檢測到表達水平較低的基因。”

　　Affymetrix 也推出了新版人類全轉錄本表達譜芯片GeneChip? Gene 2.0 ST Arrays，能夠在一張芯片上同時檢測mRNA和lincRNA。該芯片的設計結合了多個數據庫資源，包括RefSeq、Ensemble、Broad 研究所的Human Body Map lincRNAs和TUCP catalog。 “我們的超高密度芯片具有獨特的探針，能夠檢測每個轉錄本各外顯子上的多個位點，確保最大程度的捕捉相關生物學信息，” Affymetrix公司的Tsetska Takova說。

　　Arraystar 公司自2009年就開始設計lncRNA芯片，近日該公司剛剛發布了可同時檢測mRNA和lncRNA的的第三代lncRNA芯片Human LncRNA Microarray V3.0。Arraystar的技術支持專員Ed Davis介紹說，表達譜往往是研究lncRNA的第一步，不過開發lncRNA表達芯片仍然比較復雜，其中多個lncRNA數據庫并存就是一個復雜因素。“為此，我們將公共數據庫與重要lncRNA論文中的信息結合起來，建立了一個可靠的綜合性lncRNA數據庫，” Davis說。此外設計lncRNA探針也并不容易，因為lncRNA常常與附近的蛋白質編碼基因重疊。Davis介紹道，“傳統芯片探針是‘基因特異性的’，換句話說就是探針靶標轉錄本的3’端，因此無法區分轉錄起始位點或剪切方式可變所形成的多種轉錄本。但Arraystar的探針是‘轉錄本特異性的’，能夠靶標外顯子和剪接點，檢測到單個基因的不同轉錄本。”

　　lncRNA的功能

　　闡明lncRNA的功能并不容易，Davis介紹道“與microRNA不同， lncRNA能通過多種機制起作用，而且很難依據其序列來推斷其功能。” 據Affymetrix公司Takova稱，實際上目前已知功能的lncRNA還不足1%。然而，越來越多的研究顯示lncRNA在細胞正常分化和腫瘤發生中都具有重要作用。隨著人們漸漸了解到正常和疾病狀態下非編碼RNA的差異，科學家們認為可以將非編碼RNA作為生物指標進行疾病診斷和預測。

　　如何開展lncRNA功能研究呢?專家們介紹，除了表達譜研究以外，與特定lncRNA相關的蛋白編碼基因也能夠提供lncRNA功能的寶貴信息。 Illumina公司RNA和表觀遺傳學市場經理Chris Streck也認為比起只研究編碼RNA，分析整個轉錄組無疑更有價值。他指出，在ENCODE(DNA元件百科全書)計劃的推動下，研究人員現在更注重綜合性研究，包括RNA、DNA及調控功能等多個方面，其中非編碼RNA的作用日益凸顯。(ENCODE項目的目標是在人類基因組中確定所有轉錄區域、轉錄因子關聯、染色質結構和組蛋白修飾。)

　　BC Cancer Agency的博后Ewan Gibb(Wan Lam實驗室)正在研究lncRNA在疾病中的作用。“盡管不少lncRNA都已經有基因組注釋了，但大多數lncRNA的功能仍然缺乏證據，” Gibb說。“我很肯定有成千上萬的lncRNA都是功能性的，但我們仍需注意，普遍性轉錄并不意味著具有普遍性的功能。從轉錄譜著手深入闡明 lncRNA的功能是至關重要的。”例如，羅馬Sapienza大學的研究團隊就闡述了一個lncRNA的功能，它作為內源性的競爭RNA控制著肌肉分化。Gibb指出，lncRNA研究的另一項挑戰是找到lncRNA結構與其功能之間的關聯。“有研究指出，lncRNA的結構以域為基礎，這有點類似于蛋白質編碼基因，”他說，“但這種組織形式如何形成，lncRNA的結構與其功能又有何關聯，還有待進一步研究。”

　　在癌癥等疾病中的作用

　　有一點很明確，lncRNA在疾病中有重要作用。lncRNA如何對疾病進程產生強烈影響呢?安捷倫公司資深科學家Anne Bergstrom Lucas介紹了Broad研究所的一項新研究，p53通常抑制著數百個基因，若下調p53相關lncRNA的水平，就會影響這些基因的表達。“指出 lncRNA具有腫瘤抑制或致癌的直接作用，將為開發癌癥新療法打下基礎，”她說。此外，ENCODE項目的最新進展也顯示，約有80%的非編碼基因組在基因調控中起作用。

　　Gibb 正針對在人類癌癥中表達異常的lncRNA進行功能研究。“一般來說，我們可以用計算機對深度測序所得數據進行分析，以此確定疾病中表達異常的 lncRNA。而要闡明這些lncRNA的功能則依賴于傳統的生化方法，”Gibb說。“解析lncRNA在人類癌癥中的功能，不僅能大大拓展癌癥治療的靶標，也將有助于人們開發新的癌癥治療方法。例如，可以通過反義RNA或靶標lncRNA-蛋白相互作用來進行基因調控。”

　　已有許多研究顯示，lncRNA不僅是調控者，也可以作為疾病的生物指標，例如名為HOTAIR的lncRNA。HOTAIR在原發乳腺腫瘤和轉移瘤中的表達都會增加，原發腫瘤中HOTAIR的表達水平可以用來有效預測癌轉移和死亡。還有一種稱為PCA3(prostate cancer antigen 3)的lncRNA在前列腺癌中高度過表達。這種lncRNA是在尿液中發現的，相當便于臨床檢測。最近FDA已經批準了一個可以用于臨床的商業化檢測試劑盒Progensa PCA3 test。此外，據Arraystar的Davis介紹，在肝細胞癌中lncRNA-HEIH也高度表達，可以用Arraystar的LncRNA芯片進行檢測。

　　除了癌癥以外，lncRNA調控在一些遺傳疾病中有重要作用，例如lncRNA調控異常與短指/趾畸形和HELLP綜合癥有關。而且有研究顯示，lncRNA能夠穩定阿爾茨海默癥關鍵酶的mRNA。lncRNA能為我們揭示編碼基因以外的疾病調控機制么?“在我看來，最令人興奮的進展是，有越來越多的證據顯示lncRNA與主要人類疾病密切相關，而且lncRNA與蛋白編碼RNA相比，能夠更好的用于疾病診斷和預后，”Arraystar的 Davis說。希望有朝一日，非編碼RNA能夠成為幫助人們抵御疾病的有力武器。