定量PCR原理、材料與實驗方法

一．原理
應用定量PCR技術，用一種標準作對照能夠估計出一種特異性靶DNA或RNA分子的相對含量。
參照物：
在定量 PCR 中必須加入參照物，用來作為擴增系統的陽性對照，并作為未知樣本定量的標準，且通過競爭性作用校正擴增系統內管間的擴增效率，使其具有可比性。參照物按其性質不同可分為內參照和外參照。
內參照和外參照均是在定量PCR 過程中一種含量已知的標準品模板。根據參照物的不同，定量PCR分為競爭性定量PCR和非競爭性定量PCR。內參照是與待檢樣本加于同一反應管中，與樣本共用或不共用同一對引物的標準模板。共用同一對引物者，兩個模板的擴增存在競爭性，稱競爭性內參照，這種條件下進行的定量PCR屬競爭性定量PCR；相反，不共用同一對引物時則不存在競爭性，為非競爭性內參照，屬非競爭性定量PCR。
外參照則是參照物與待檢樣本的擴增分別在不同的管間進行。采用外參照進行的定量PCR屬非競爭性定量PCR。
非競爭性對照基因定量法：
即是靶基因與參照基因的同步擴增。是在同樣的反應條件下，在一個試管內同步擴增來自同一DNA 的一段靶序列和另一段內標序列(通常是管家基因或它們的mRNA)。此內標序列可控制DNA的量、可擴增性和管間擴增效率的變化。通過比較兩種序列的擴增產物電泳帶的顏色強度對靶基因定量。此法只有在靶序列和作為對照的內標序列的含量及擴增效率相似時才能得到準確的定量結果。這種擴增效率的差異常發生在 PCR 的終末期，所以zui好定量處于擴增指數期的PCR 產物。擴增后可通過測量電泳帶的相對強度而定量。只有當靶序列和內標序列以相同的量存在時，才能對兩者進行相對定量。
競爭性PCR：
競爭PCR 與前述方法相似，即靶基因與參考標準在同一反應管中共同擴增，但參照標準通常是一段人工合成的模板而不是內源性基因。競爭PCR 必須構建一個內部標準，此標準能與靶基因競爭聚合酶、核苷酸和引物分子，具有相同的引物結合位點，其擴增產物能通過電泳或高效液相色譜(HPLC)等方法區分開來。對競爭性模板作系列稀釋后加入到恒量的樣品DNA中進行PCR，靶基因的量取決于所添加的競爭性DNA片段的量，使兩者的PCR終產物有相等摩爾數。競爭PCR 有效地控制了不同反應管間擴增效率的差異。若反應條件達到要求，可不必使反應限制于指數擴增期，靶序列可在較大范圍內獲得定量并能檢測到其2 倍的差別。因此,競爭性PCR 是應用zui廣的定量PCR 方法。通過競爭性PCR 進行絕對定量的條件是靶序列和競爭序列的擴增效率相同、引物相同，靶基因和競爭基因的初始比值在整個反應過程中保持不變。
二．材料與方法
1．使用外參照的半定量PCR
1） 肝臟總RNA的提取與定量
(1) 肝臟總RNA的提取按第二部分實驗一進行。
(2) 肝臟總RNA的定量
將提取的總RNA稀釋一定的倍數后，用紫外分光光度計測定 260nm和280nm兩個波長處的光吸收值，然后按以下公式來計算提取得到的總RNA的濃度：[RNA濃度]=A260×40× 稀釋倍數 μg/ml 260nm和280nm 兩處讀數的比值（A260/A280），可反映核酸的純度。DNA 和RNA 純品的A260/A280的值分別為1.8 和2.0 如果樣品中有蛋白質或酚的污染，則A260/A280將明顯低于此值，此時就無法對樣品中的核酸進行精確定量。
獲得總RNA濃度后，用RNase-Free Water 將總RNA濃度調整為1μg/μl。

2）cDNA樣品的制備

（1） 材料
RNA樣品

（2）儀器、用具
PCR儀、電泳儀等、0.2mlPCR 管（1個）、移液器、碎冰

（3）試劑
RNase Free dH2O；5×RT Buffer(含25mM Mg2+)；dNTP(10mM each)；RNase Inhibitor(10U/μl )；Oligo (dT)20(10μmol/L)；ReverTra Ace
3） 方法
(1) 以總RNA為模板，合成cDNA*鏈，體系如下：

(2) 反轉錄反應條件為：30℃ 10min，42℃ 30min ，99℃ 5min，4℃ 5min。
注：必須將所有樣品的總RNA的加樣量均為 1
4）PCR
(1) 待測基因cNDA片斷的獲得
① 根據待測基因的已知序列設計一對特異引物，利用該引物進行PCR反應。PCR反應體系為：

② PCR 擴增反應條件：94℃預變性3min；然后進行30個循環反應，其溫度循環條件
為：94℃變性1min，55℃退火1min，72 ℃延伸1min；循環結束后72℃再延伸5min。
(2) 外參照β-肌動蛋白cDNA片斷的獲得
① 根據β-肌動蛋白基因序列設計一對特異引物，利用該引物進行PCR反應。PCR反
應體系為：

② PCR 擴增反應條件：94℃預變性3min；然后進行30個循環反應，其溫度循環條件為：94℃變性1min，55℃退火1min，72 ℃延伸1min；循環結束后72℃再延伸5min。

(3) PCR 產物經在2%瓊脂糖凝膠上電泳后用凝膠成像系統及相關軟件進行分析，結果以待測基因與β-肌動蛋白mRNA的RT-PCR產物亮度之比（%）表示。

2．使用競爭性內參照的定量PCR

1） 肝臟總RNA的提取與定量、組織cDNA樣品的制備方法見1。

2） 競爭標準cDNA的制備


圖 4－4。 競爭PCR引物設計示意圖
(1) 根據待測基因序列設計一對引物（圖1），用正向特異引物Primer1 和特別設計的反向
引物Primer2進行PCR擴增：
(2) PCR反應體系為：

(3) PCR 擴增反應條件：94℃預變性3min；然后進行30 個循環反應，其溫度循環條件為：
94℃變性1min，55℃退火 1min，72 ℃延伸1min；循環結束后72℃再延伸5min。

(4) 在1%瓊脂糖凝膠上對PCR產物進行電泳檢測，方法與試驗二相同。

(5) PCR產物經在2%瓊脂糖凝膠上電泳分離后，將PCR產物進行膠回收。結果就得到一競爭標準cDNA片斷，該片斷相當于待測片斷內部產生1個60bp的缺失。

3）競爭PCR

(1) 通過連續2倍稀釋配制系列濃度的cDNA競爭標準，這些競爭標準cDNA梯度溶液分別加入到一定量的組織cDNA樣品中（預實驗確定），再用正向引物 Primer 1 和Primer 3（圖1）同時擴增組織中的待測基因cDNA和競爭標準cDNA，PCR擴增體系如下：

(2) PCR 擴增反應條件：94℃預變性3min；然后進行30 個循環反應，其溫度循環條件為：94℃變性1min，55℃退火1min，72 ℃延伸1min；循環結束后72℃再延伸5min。
(3) PCR產物經在2%瓊脂糖凝膠上電泳（方法與試驗二相同）后用凝膠成像系統及相關軟件進行分析，樣品待測基因cDNA條帶與競爭標準cDNA條帶可據片斷大小而區分并定量。根據樣品待測基因cDNA 條帶與競爭標準cDNA 條帶亮度之比，則可利用競爭標準cDNA確定組織樣品待測基因cDNA含量，再通過樣品待測基因cDNA的PCR產物分子量將其含量換算成待測基因 mRNA數量。