小鼠胚胎干細胞培養實驗步驟（三）

ITSFn and N3（分化培養基）：
配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分裝在15ml 離心管中，（稀釋為1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm濾膜過濾，貯存在-20℃。將該溶液加入DMEM/F12中制備培養基，貯存于4℃。
貯存液          
DMEM(高糖)          
轉鐵蛋白50mg/ml          
胰島素5mg/ml          
亞硒酸鈉300μM          
黃體酮（20μM）          
腐胺（100μM）          
PEST（P104U/ml S104μg/ml）          
層粘連蛋白100μg/ml          
纖維連接蛋白250μg/ml           
堿性rhFGF, 10μg/ml          
*在第4步將bFGF加入N3培養基使終濃度為10ng/ml。

ITSFn and N3培養基貯存液的準備
使用無菌的溶劑和稀釋液，在分裝之前要對溶液進行過濾，如果因為某些原因溶液在分裝之前沒有進行過濾，需要在管子上標明以便別人在使用時知道該溶液不能直接用于細胞培養。
貯存液  溶劑，貯存液，稀釋劑和儲存
轉鐵蛋白50mg/ml  
胰島素5mg/ml  
亞硒酸鈉300μM  
黃體酮（20μM）  
腐胺（100μM）  
PEST（P104U/ml S104μg/ml）  
層粘連蛋白（100μg/ml）  
纖維連接蛋白（250μg/ml ）  
堿性rhFGF, （10μg/ml）  

包被有多聚鳥氨酸/纖維結合蛋白的培養板（使用或不使用蓋玻片）

包被液的準備
多聚-L-賴氨酸，15μg/ml
把75ml多聚-L-賴氨酸和425ml 1×PBS混合。貯存在4℃。
纖維結合蛋白，1μg/ml
把0.5ml纖維結合蛋白和500ml 1×PBS混合。

包被過程：
1．加入多聚-L-賴氨酸，至少2－3小時（過夜也行）
2．吸出多聚-L-賴氨酸
3．加入纖維結合蛋白，大約1－2小時
4．吸出纖維結合蛋白，放置30分鐘晾干
5．貯存在4℃
24孔板用200μl，6孔板用500μl。震蕩培養板確保溶液能夠覆蓋蓋玻片或培養孔。有時需要劇烈震蕩培養板。

體外分化方法

第1步：ES培養基
在LIF存在的條件下維持細胞培養

第2步：EB培養基
使用細菌培養皿去除LIF后胚狀體的形成需要4天。
1．分散純化細胞（參見上面的細胞傳代部分）
2．純化2小時后將細胞轉入含有ES培養基的50ml Falcon管中，計數細胞取適量體積放入15ml管中離心3分鐘。
3．用2mlEB培養基重懸細胞，吹打至少10次制成單細胞懸液
4．一個15cm的細菌培養皿接種4～5×106個細胞（1個完全融合的組織培養皿通常足以接種4個同樣規格的細菌培養皿）。
5．2天后更換培養基
將胚狀體轉入錐形管中放置3～5分鐘使細胞沉降。棄去上清，將細胞重懸于新鮮培養基并接種在新的細菌培養皿中。
6．用EB培養基培養的第4天將細胞轉入沒有包被的組織培養皿中（這即是細胞的移植步驟）。1個組織培養皿之中放置1個細菌培養皿，在進行第3步之前一天將胚狀體黏附在同樣規格的培養板上。
形成胚狀體需要4天時間。在EB培養基中再培養1天使胚狀體粘附在組織培養皿的表面。這一天被認為是第2步和第3步的分界。