【干貨】細胞凍存與復蘇

　　很多時候，我們需要把細胞冷凍起來，以便于長期保存，以備不時之需。而復蘇，就是使冷凍的細胞蘇醒過來，恢復活力。

　　其實，細胞凍存和復蘇的protocol教科書和實驗手冊上面都有，毛博我不想再重復了。這里，毛博根據自己做細胞培養近10年的經驗和體會，談談應該注意的一些事項和技巧。大部分都是血淚教訓和經驗總結，都是干貨喲。

　　一、冷凍越慢越好，復蘇越快越好

　　高大上的實驗室可以使用程序冷凍儀，一切由機器代勞，屌絲實驗室就只好用人肉程序冷凍儀。具體的protocol，到處都有。毛博想提醒大家的是，細胞冷凍越慢越好，寧慢勿快。做細胞冷凍前，事先留出充足的時間。

　　而復蘇速度越快越好：從液氮罐里取出來之后，迅速放在37°C水浴中，然后使勁搖呀搖，令其盡快融化。

　　二、高高興興上班，平平安安回家

　　細胞凍存和復蘇是細胞培養技術里面最容易出事的部分，凡是和液氮接觸的操作，注意戴保護眼鏡和手套。最需要小心的是：復蘇的時候，在水浴中搖呀搖的時候，有時候小瓶會爆炸的。所以，一定要戴保護眼鏡和手套。

　　不多說了，說多了滿眼都是淚。還有，凍存液中的DMSO是有毒致癌的，接觸的時候一定一定要帶好手套。

　　三、凍存細胞數量要足夠

　　無論再怎么小心，細胞在冷凍和復蘇過程中總會死掉一批的。所以，一開始凍存細胞的數量要足夠。一般最低要達到5×106／毫升，一瓶不夠兩瓶湊。但是，這個不能一概而論。有些細胞，比如：雜交瘤細胞，只需要1－3x106／毫升。

　　四、做好標記

　　把培養瓶放入提手，末端應該扎有小牌，注明主人的名字，細胞名稱和凍存日期。還要在每個凍存管上寫上細胞名稱，代數和凍存日期。

　　實驗室的液氮罐都是公用的，每個人應該有屬于自己的提手。毛博當年就發生過為了找自己的細胞，被迫把整個液氮罐翻了個底朝天的慘劇。

　　五、細心呵護

　　剛剛復蘇的細胞就象剛剛出生的baby，非常脆弱，需要我們的細心呵護。培養液要事先在培養箱或者水浴中復溫，一切的和細胞接觸的動作都要輕柔。

　　把細胞從凍存管里吸出來，注入離心管，要輕輕地吸取和滴加。包括給離心管補加培養液的時候，都要輕輕地滴加。離心要用低速離心（500－1000轉／分鐘），吹打要用專用的吹打管，而不要圖方便用移液槍，吹打也要輕輕的。

　　六、DMSO的問題

　　上面提到了DMSO是一種有毒致癌物質。那么，解凍之后，應不應該去除凍存液中的DMSO呢？答案是no。除了極少數特別注明的對DMSO敏感的細胞外，99％的細胞都不需要去除DMSO，解凍后的頻繁換液會慢慢去除掉DMSO的。

　　七、物離鄉貴，人離鄉賤

　　解凍后的細胞要用和以前一樣的培養液和血清。因為每一種細胞都有自己特定的，并且已經熟悉了的生長環境。突然使用不一樣的培養液和血清，會造成細胞生長不良，甚至死亡。這和一個人突然離家千里，會水土不服是一樣的道理。

　　細胞培養是個苦活，根本離不開人。毛博還記得當年當實驗狗的時候，放個長假都要惦記著培養箱里面的細胞是不是該換液了。而掌握了有效的凍存和復蘇的技術，就可以解決這個問題。春節回家前把細胞都凍上，過了年回來再開干。