張鋒參與Cell發布CRISPR重要新成果

　　一直以來研究人員都無法在哺乳動物細胞中實現高通量的靶向基因編輯，CRISPR-Cas9系統的應用標志著遺傳篩查一個重大的突破。

　　現在，來自哈佛-麻省理工Broad研究所的研究人員將這一篩查技術應用于小鼠骨髓源性樹突狀細胞，研究了PAMPs觸發的免疫反應的調控機制。通過綜合分析基因敲除結果及蛋白質和mRNA表達改變，他們利用CRISPR篩查以前所未有的分辨率剖析了免疫調控網絡。這一重要的成果發布在7月16日的《細胞》（Cell）雜志上。

　　哈佛-麻省理工Broad研究所的Aviv Regev博士和Nir Hacohen博士是這篇論文的共同資深作者。著名華人科學家、CRISPR-Cas9技術的先驅開創者張鋒（Feng Zhang）博士是這篇論文的合著作者（延伸閱讀：Nature大型訪談：張鋒博士暢談CRISPR改造生殖細胞 ）。

　　遺傳篩查是一種可用于鑒別促成特異生物學表型或疾病環境的單個基因或基因網絡的強大方法。RNA干擾（RNAi）技術是當前最有效的遺傳篩查技術，但卻存在著不完全基因抑制及廣泛脫靶效應等問題。將CRISPR-Cas9基因編輯技術應用于各種細胞類型中進行正向遺傳篩查，將從根本上提高在哺乳動物細胞中開展這類遺傳篩查的能力。

　　去年的一年里，多個研究小組相繼報道在哺乳動物癌癥和干細胞系中采用CRISPR-Cas9系統進行全基因組基因敲除篩查，鑒別出了增殖必需的基因，并揭示出了介導對藥物和毒素產生耐受的一些基因。2015年，一項在小鼠中完成的體內全基因組CRISPR篩查研究進一步鑒別出了驅動腫瘤生長和轉移的功能喪失突變。這些初步的負向和正向選擇篩查確立了開展全基因組CRISPR篩查的可行性，并顯示了CRISPR在以高靈敏度和特異性生成一些新生物學見解方面的能力。

　　現在，哈佛-麻省理工Broad研究所的研究人員利用這一技術解構了一個復雜的生物學過程，第一次在哺乳動物中應用CRISPR-Cas9解答了一個系統級生物學問題。研究人員報告稱，他們篩查了原代的小鼠骨髓源性樹突狀細胞(DCs)，剖析了與誘導腫瘤壞死因子（TNF）相關的調控網絡。

　　作者們利用分離自表達Cas9轉基因小鼠的骨髓源性DCs研究了通過Toll樣受體(TLR) 對脂多糖(LPS)產生的天然免疫反應。在用LPS激活DCs后，他們對這些離體細胞進行了全基因組混合CRISPR篩查，基于炎癥細胞因子TNF的高水平或低水平蛋白質表達情況分選了這些細胞。這一初期的篩查鑒別出了大多數已知的TNF表達及TLR4信號調控因子，并用單條單向導RNA(Single guide RNA,sgRNA)驗證了一些新蛋白。隨后，研究人員對排名前列的2,569個基因進行了更深入的二次篩查，以更高的敏感度揭示出了另外一些TNF表達調控因子。

　　隨后，研究人員基于它們對樹突狀細胞功能選擇性標記物RNA和蛋白質表達的影響，對所有已知和新鑒別出的調控因子進行了賦值。除了已知的TLR信號調控因子，還鑒別出了由從前未發現與TNF調控或炎癥基因表達相關的一些基因組成的兩個組件：一個是OST蛋白質糖基化復合物和內質網（ER）折疊及易位信號通路；另一個是參與了轉錄延伸調控的PAF復合物。盡管尚不清楚OST和PAF復合物是如何在分子水平上影響TLR信號通路的，這一研究表明了需要無偏倚地去探查功能網絡以了解細胞內一些生物學功能的關聯。

　　哈佛-麻省理工Broad研究所的研究人員所開展的CRISPR篩查其中一個新穎之處在于，他們將這一技術應用于原代細胞研究了與傳染病相關的免疫信號。近期一項類似的研究報告稱利用全基因組RNA干擾篩查，揭示出了由病原相關分子模式(PAMPs)觸發的天然免疫信號。

　　在這項Cell研究中，作者們報告稱發現了一個新的PAMP，并檢測出了一些TRAF復合物組件，但這一篩查還遠未達飽和。CRISPR-Cas9技術有潛力在哺乳動物細胞中實現飽和遺傳篩查，使得能夠解譯出幾近完整的分子信號通路。

　　研究人員結合CRISPR篩查和細胞分選，還揭示出了一些特殊蛋白質或細胞增殖之外一些生物表型的調控因子。這一方法可以適用于廣泛的靶標，并有著巨大的潛力用于鑒別未確定特征的調控網絡。

　　當我們學習將這一不可思議的技術應用于遺傳篩查時，不應該忘記CRISPR-Cas9系統還有一些潛在的缺陷：例如，在進行全基因組篩查時，應考慮到由于低文庫覆蓋度或脫靶效應導致檢測出一些假陽性和假陰性靶蛋白。

　　在這篇Cell文章中，研究人員采用一些策略：根據適當的陽性對照例如基因本體注釋及一組參考必需和非必需基因來評估篩查性能，并測量初次篩查擊中蛋白的頻率有效地解決了這些問題。通過更深入的二次篩查研究人員減少了相比于全基因組文庫的大小，有限的細胞數量造成的假陰性。

　　作者們指出，全基因組CRISPR篩查已經開始徹底地改變對調控網絡的研究，并打開了通往系統層面上一些新研究發現的大門。