微生物的實驗室培養

1. 培養基是人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質，是進行微生物培養的物質基礎。

2. 常見的培養基包括：液體狀態的液體培養基，可用于工業生產；添加了凝固劑(如瓊脂)的固體培養基，常用于微生物分離、鑒定，活菌計數，菌種保藏等，微生物在固體培養基表面生長可形成肉眼可見的菌落。

3. 培養基一般都含有水、碳源(包括無機碳源如CO2、有機碳源如葡萄糖)、氮源(包括無機氮源如NH3、有機氮源如蛋白質)和無機鹽。

4. 培養基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質(即生長因子)以及氧氣的要求。

5. 獲得純凈培養物的關鍵是防止外來雜菌的入侵。

6. 消毒是使用較為溫和的物理或化學方法殺死物體表面或內部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)；滅菌是使用強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物(包括芽孢和孢子)。

7. 常用的消毒方法：煮沸消毒法(在100 ℃煮沸5～6 min)，日常生活中常用于一般物品的消毒；巴氏消毒法用水浴鍋操作(在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min)，用于一些不耐高溫的液體，如牛奶的消毒；化學藥劑消毒法，如用酒精擦拭雙手、用Cl?消毒水源等；紫外線消毒法(紫外燈照射30 min)，用于接種室、操作臺的表面滅菌和空氣滅菌。

8. 常用的滅菌方法：灼燒滅菌(酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒)，用于接種工具或其他金屬用具的滅菌和試管口或瓶口的滅菌；干熱滅菌(在干熱滅菌箱內160～170 ℃加熱1～2 h)，用于玻璃器皿(吸管、培養皿)和金屬工具等的滅菌；高壓蒸汽滅菌(在高壓蒸汽滅菌鍋內壓力為100 kPa，溫度為121 ℃的條件下15～30 min)，用于培養基及容器的滅菌。

9. 制作Meat extracts, beef蛋白胨固體培養基的步驟：①計算各成分的用量；②稱量，注意要使用稱量紙、動作要迅速、稱后及時蓋瓶蓋；③溶化，注意將Meat extracts, beef連同稱量紙一起放入燒杯，保證粘附在稱量紙上的Meat extracts, beef也能溶入水中；④滅菌，將培養基轉移至錐形瓶，加棉塞，包上牛皮紙，在高壓蒸汽滅菌鍋內滅菌15~30min，將5~8套培養皿用幾層報紙包緊作一包，在干熱滅菌箱內滅菌2h；⑤倒平板，培養基50℃左右時在酒精燈火焰附近操作。

10. 倒平板時要注意：全程在酒精燈火焰附近操作；錐形瓶的瓶口通過火焰灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基；培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙即可；等待平板冷卻凝固(大約需5～10min)后，將平板倒過來放置，既可以使培養基表面的水分更好地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。

11. 菌落是單個或少數細菌在固體培養基上大量繁殖時，形成的肉眼可見的、具有一定形態結構的子細胞群體。

12. 平板劃線法是通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基的表面，MAX終分離得到單菌落。

13. 接種環的灼燒：①劃線前：消滅接種環上的微生物，避免污染培養物；②每次劃線前：殺死接種環上的殘留菌種，保證每次劃線菌種來自上次劃線末端；③劃線結束后：殺死接種環上的殘留菌種，避免污染環境和感染操作者。

14. 灼燒接種環之后，要冷卻后再進行操作，以免接種環溫度太高殺死菌種。

15. 第二次劃線以及其后的劃線操作，要從上一次劃線的末端開始劃線，使細菌的數目隨著劃線的次數增加而逐步減少，MAX終得到由單個細菌繁殖而來的菌落。

16. 稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布在瓊脂固體培養基的表面，進行培養。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞，從而在培養基表面形成單個的菌落。其主要操作步驟包括系列稀釋操作和涂布平板操作。

17. 稀釋涂布平板法操作時，應注意以下操作以防止雜菌污染：每支試管及其中的9 mL水、移液管等均需滅菌；操作時，試管口和移液管應在離火焰1～2 cm處；涂布器用體積分數為70%酒精消毒，取出時，讓多余酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰上引燃；移液管管頭不要接觸任何物體。

18. 稀釋涂布平板法可用于微生物計數，但需涂布多個平板，操作較復雜。

19. 未接種的培養基可作為空白對照，若其在恒溫箱保溫1~2d后無菌落生長，說明培養基的制作是成功的，否則需要重新制備。

20. 若接種成功，在培養基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。

21. 對于頻繁使用的菌種，可以采用臨時保藏的方法。將菌種接種到試管的固體斜面培養基上，在合適的溫度下培養。當菌落長成后，將試管放入4℃的低溫培養箱中保藏。以后每3～6個月，都要重新將菌種從舊的培養基上轉移到新鮮的培養基上。

22. 菌種的臨時保藏方法保存的時間不長，菌種容易被污染或產生變異。

23. 對于需要長期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。在3mL的甘油瓶中，裝入1mL甘油后滅菌。將1mL培養的菌液轉移到甘油瓶中，與甘油充分混勻后，放在-20℃的低溫培養箱中保存。