微生物所建立無痕迭代DNA組裝新方法

　　DNA組裝與DNA合成技術并稱為合成生物學的兩大基礎使能技術。在合成生物學和生物工程領域中，“設計-構建-驗證-學習（Design-Build-Test-Learn，DBTL）”的循環工程，精細的遺傳元件無縫拼接以及重復DNA序列（如CRISPR和TALEN結合序列）串聯分別需要迭代、無痕和序列重復的DNA組裝技術。目前酶切連接的組裝方法被廣泛地應用于迭代組裝，其中BioBrick組裝法則是最早發展起來的DNA標準化組裝技術，已成為國際基因工程機器大賽iGEM的組裝標準。然而，BioBrick及其類似的組裝方法在DNA連接處形成6–21 bp的疤痕序列，影響DNA完整性和mRNA正確折疊，且不適用于序列嚴格依賴的遺傳元件的精確組裝。

　　中國科學院微生物研究所病原室溫廷益研究組建立了基于IIP和IIS型限制性內切酶（RE）的DNA組裝方法，命名為PS-Brick。與在兩端加入RE識別序列的現有DNA組裝技術不同，本方法僅在PS-Brick供體DNA的一端巧妙設計了毗鄰的IIP和IIS型RE識別序列，并且保留了另外一端的PCR產物特性，解決了目前基于RE的DNA組裝方法普遍存在“疤痕”序列問題。該技術使用IIP型RE切割供體DNA產生一個粘性末端，同時保留PCR產物的另一個平末端或加A粘性末端；使用IIP和IIS型RE同時切割載體，IIP型RE產生粘性末端，IIS型RE產生平末端或單堿基粘性末端，雙酶切后IIS型RE的識別序列脫離載體。由相同IIP型RE切割的供體和載體的粘性末端進行連接，組裝后的載體重新產生與初始載體相同的毗鄰IIP/IIS型RE識別序列對，作為下一輪PS-Brick組裝的入口，從而實現迭代組裝。供體DNA的平末端或加A粘性末端與IIS型RE切割的載體平末端或單堿基粘性末端進行連接，形成無“疤痕”序列的連接“焊點“，從而實現無痕組裝。從供體DNA制備到組裝產物轉化感受態細胞并涂布平板，一輪PS-Brick組裝可在一個工作日內完成。PS-Brick方法的組裝效率達到104–105 CFUs/μg DNA，組裝正確率約為90%，滿足常規分子克隆和建庫的需求。

　　研究人員進一步應用PS-Brick方法開展了蘇氨酸和正丙醇代謝工程研究。應用PS-Brick迭代組裝的特性，開展了多輪DBTL循環的代謝工程研究，逐步解除了關鍵酶ThrA的反饋抑制、消除了代謝瓶頸、增強了外排轉運途徑以及阻斷了降解途徑，構建了高效的蘇氨酸和正丙醇工程菌。除了迭代組裝的優點，PS-Brick無痕組裝實現了ThrA飽和突變以及調控翻譯起始的雙順反子元件的精確拼接；PS-Brick重復序列組裝實現了3個含有相同啟動子和sgRNA的CRISPR基因組編輯序列的串聯整合。

　　該研究建立了簡單高效的PS-Brick組裝方法，可同時實現迭代、無痕和序列重復的DNA組裝。現有的DNA組裝技術難以同時實現這三種組裝性能，因此PS-Brick為合成生物學和代謝工程提供了一種有價值的使能技術。該研究成果已于近日發表于Biotechnology for Biofuels。該研究得到中科院戰略性先導科技專項、國家自然科學基金和中科院青促會等的資助。

PS-Brick組裝流程圖